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    NGS建庫人都在用的文庫質量評定方法,你都知道嗎?

    發(fā)布時間: 2021-10-25  點擊次數(shù): 2389次

    高通量測序(Next Generation Sequencing,NGS)近年來飛速發(fā)展,在各個領域已被廣泛應用。而文庫的制備是NGS技術中極為重要的步驟。所謂文庫制備(Library Preparation)就是在DNA的片段兩端連接上特定序列的接頭的過程,讓文庫可以在高通量測序平臺上進行測序。


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    文庫構建的最終目的在于成功測序,并獲得序列信息。那么如何判定這個文庫能否上機測序呢?想必這是大家一致關注的問題。


    文庫的數(shù)量和質量是能否成功測序的關鍵。文庫的濃度文庫分布是評價文庫質量的兩個關鍵參數(shù)。



    文庫濃度測定


    文庫構建完成后,我們首*行文庫濃度的測定。核酸定量的方式有多種,但基于紫外分光光度的測定方法相對不夠精準定量,比如Nanodrop或酶標儀,我們推薦使用染料法進行核酸定量,在文庫構建中比較常用的核酸定量儀器是Thermo Life Qubit 3.0熒光定量儀。

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    文庫分布檢測

    如果文庫濃度符合上機需求,接下來我們用Agilent 2100生物分析儀來檢測其片段大小是否符合預期,其峰值大小應該是目的片段加上接頭序列的總長度。

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    除ATAC、cfDNA和small RNA等特殊文庫外,一般情況下,好的文庫應該呈現(xiàn)出單一的、圓滑的峰且接近正態(tài)分布,并且文庫中小于280 bp和大于1000 bp的片段占比不要過大(如大于20%)都可上機測序。

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    圖1:常規(guī)文庫2100峰型圖

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    圖2:cfDNA文庫2100峰型圖

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    圖3:ATAC文庫2100峰型圖


    常見問題和解決方案


    Q1
     文庫峰型偏大
    A1

    這種情況出現(xiàn)可能因一輪分選方案中磁珠用量過少,導致大片段殘留過多。為保證文庫主峰在合格上機范圍內,可增加分選方案中一輪磁珠用量來解決。

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    圖4:文庫峰型偏大


    Q2
     在150 bp以下出現(xiàn)雜峰
    A2

    這種情況可能是因為引物二聚體或者接頭二聚體的出現(xiàn)所致,一般引物二聚體的長度在100 bp以下,接頭二聚體的長度在125 bp左右。為保證測序數(shù)據(jù)的質量,可以通過減少引物使用量、連接反應前稀釋接頭,降低磁珠的比例對文庫進行再一次純化來解決。

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    圖5:接頭、引物殘留峰型圖

    (紅色箭頭標注為引物殘留,藍色箭頭標注為接頭殘留)


    Q3
     upper marker出現(xiàn)翹尾
    A3

    高產量文庫通常會出現(xiàn)不同程度的過度擴增現(xiàn)象。因為在文庫擴增后期,通常引物被最先耗盡,大量文庫片段在無法結合到引物的情況下,片段之間通過不*匹配關系退火結合,從而形成部分雙鏈+部分單鏈的雜合鏈,且片段更大。根據(jù)不同檢測方式的對應原理,過度擴增產物在Agilent 2100 生物分析儀峰型中表現(xiàn)為upper marker之后有輕微翹尾;但以上現(xiàn)象均屬正常,不影響文庫測序和數(shù)據(jù)分析。

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    圖9:過度擴增峰型圖

    通過以上介紹,小伙伴們是不是對文庫質量評定一目了然了呢?那就趕緊動手吧!



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