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病原微生物提取的方法有哪些?
發(fā)布時(shí)間: 2021-10-25 點(diǎn)擊次數(shù): 1607次數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
據(jù) WHO 統(tǒng)計(jì),全球感染性疾病導(dǎo)致的患者死亡占全部死因的 25%以上,在中國(guó),感染性疾病占所有疾病的 50%以上,75%造血系統(tǒng)腫瘤患者和 50%實(shí)體腫瘤患者死于感染,膿毒癥(嚴(yán)重感染)患者病死率高達(dá) 50%。而在面對(duì)疑難重癥時(shí),快速檢測(cè)病原微生物變得刻不容緩。 病原微生物是指侵犯入人體引起感染的微生物,或稱(chēng)病原體。病原微生物包括病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲(chóng)和朊毒體等。mNGS就是綜合分析來(lái)自患者樣本的病原微生物的基因物質(zhì)(DNA和RNA),實(shí)現(xiàn)病原種屬的快速鑒定和深入分析。mNGS檢測(cè)技術(shù)由于通量高、快速、成本適宜、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn),在感染性疾病領(lǐng)域應(yīng)用愈發(fā)火熱,同時(shí)也正在改變?cè)械臋z測(cè)手段,大大提高了危急重癥和疑難感染的診斷水平。
mNGS檢測(cè)流程包括:臨床評(píng)估、樣本收集、保存和運(yùn)輸、核酸提取、文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)分析和出具報(bào)告幾大步驟。多數(shù)臨床標(biāo)本存在大量宿主細(xì)胞和宿主游離核酸,微生物核酸豐度相對(duì)較低,有些樣本中人源宿主DNA占比高達(dá)50-90%左右,這會(huì)導(dǎo)致后續(xù)測(cè)序數(shù)據(jù)中大部分是宿主DNA的信息,而病原微生物的數(shù)據(jù)占比較少,且宿主DNA 的非特異性序列還會(huì)干擾下游病原微生物的的判斷。針對(duì)這一問(wèn)題,通常在核酸提取環(huán)節(jié)時(shí)去除宿主DNA或者增加測(cè)數(shù)據(jù)量的方式來(lái)提高病原微生物的檢出。接下來(lái)小編跟大家介紹幾個(gè)去除宿主DNA的小妙招~
目前去除宿主DNA的方法主要分為提取DNA前去除和提取DNA后去除。提取DNA前去除包括物理法、生物法、化學(xué)法,而提取DNA后去除主要通過(guò)抗甲基化DNA磁珠來(lái)實(shí)現(xiàn)。
1.物理法
該方法基于宿主細(xì)胞和微生物細(xì)胞大小的差異去除宿主細(xì)胞,例如粘膜上皮細(xì)胞平均大小為50 μm,而一些典型的細(xì)菌細(xì)胞一般是1 μm。這種情況下可以采用過(guò)濾法去除宿主細(xì)胞,或者根據(jù)細(xì)胞沉降系數(shù)的差別,利用離心法去除宿主細(xì)胞。但是該種方法無(wú)法有效去除胞外DNA。
2.生物法
基于微生物和動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不同,選擇性的裂解宿主細(xì)胞,利用核酸酶酶解掉釋放出來(lái)的宿主DNA,后利用珠磨、PK蛋白酶等方式裂解微生物,最后純化微生物DNA?;蛘咭部梢岳萌嗽醇?xì)胞的細(xì)胞膜較微生物外壁脆弱的特點(diǎn),在核酸提取前用溫和去污劑(如皂苷)裂解宿主細(xì)胞釋放 DNA,再用DNaseⅠ酶解裸露的宿主DNA ,后續(xù)進(jìn)行微生物DNA提取等操作。該種方法通常可使微生物富集效率提高1000倍[1]。
3.化學(xué)法
PMA(疊氮碘化丙錠)是一種可以高效結(jié)合dsDNA的染料,二者結(jié)合后熒光會(huì)增強(qiáng),在可見(jiàn)光的誘導(dǎo)下,PMA分子的疊氮化物基團(tuán)被光解并發(fā)生C-H插入反應(yīng)并與DNA形成共價(jià)鍵,從而產(chǎn)生恒久性的DNA修飾,從而使DNA的片段化。由于這種染料無(wú)法通過(guò)功能完整的細(xì)胞膜,所以其可以標(biāo)記裸露在外的DNA。該種方法先利用低滲溶液破壞人源宿主細(xì)胞,后利用PMA去除宿主DNA,后結(jié)合用珠磨、PK蛋白酶等方式裂解微生物,最后提取微生物DNA[2]。
4.抗甲基化DNA磁珠
在原核生物中,DNA甲基化主要發(fā)生在腺嘌呤堿基(A)上,在真核生物中,DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶堿基(C)上,人類(lèi)基因中有90%以上的CpG位點(diǎn)被甲基化修飾。該方法先提取全部的DNA,利用帶有蛋白A修飾的磁珠,通過(guò)MBD2-Fc蛋白媒介,與宿主DNA中甲基化的CpG位點(diǎn)特異結(jié)合,可有效去除高達(dá)98%的甲基化宿主DNA,從而針對(duì)性的去除真核生物中常見(jiàn)的甲基化的核苷酸序列,可實(shí)現(xiàn)3~5倍富集[3]。
如果某些微生物甲基化模式和宿主類(lèi)似,在去除宿主DNA時(shí)也會(huì)被去除。
【參考文獻(xiàn)】
[1] Charalampous T, Kay GL, Richardson H, et al. Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection[J]. Nat Biotechnol, 2019, 37(7): 783‐792. DOI:10.1038/s41587‐019‐0156‐5.
[2] Marotz CA, Sanders JG, Zuniga C, et al. Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion [J]. Microbiome, 2018, 6(1): 42. DOI: 10.1186/ s40168‐018‐0426‐3.
[3] Miller S, Naccache SN, Samayoa E, et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid[J]. Genome Res, 2019, 29(5): 831‐842.DOI:10.1101/gr.238170.118.
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