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實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化(五)
發(fā)布時(shí)間: 2021-10-12 點(diǎn)擊次數(shù): 1076次想要提高探針的的效果,可以考慮在探針上采用LNA(鎖核酸)堿基或MGB(小溝結(jié)合劑)基團(tuán)。
這樣做的效果是:
1、增強(qiáng)探針與靶序列的雜交強(qiáng)度。增強(qiáng)結(jié)合的特異性后,背景噪聲降低,從而提高整個(gè)實(shí)驗(yàn)的靈敏度。
2、一般為滿足設(shè)計(jì)要求,AT序列豐富的探針需要長(zhǎng)達(dá)40個(gè)核苷酸。通過LNA堿基或MGB的取代,可以將長(zhǎng)度減少至13~20個(gè)核苷酸,而不影響效果。
為什么這樣的方法可以提高探針的效果?
LNA堿基是一種核苷酸類似物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)可以限制DNA構(gòu)象為理想的Waston-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)。每插入1個(gè)LNA堿基,可以使Tm值增加3~6°C。
MGB基團(tuán)是一個(gè)能結(jié)合到DNA小溝的三肽分子,能與互補(bǔ)的單鏈DNA高特異性、高強(qiáng)度地結(jié)合。
例如SNP基因分型實(shí)驗(yàn),要求所有引物、探針復(fù)性溫度一致的多重PCR實(shí)驗(yàn),就很適合使用這個(gè)方法。
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