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    實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化(六)

    發(fā)布時(shí)間: 2021-10-14  點(diǎn)擊次數(shù): 1114次

    引物和探針的濃度也需要尋找*濃度,這通常憑借經(jīng)驗(yàn)決定。


    為什么要尋找*濃度呢?


    因?yàn)橄馮aqman探針在反應(yīng)過程中會(huì)被破壞,需要在起始濃度便保留足量的探針。這個(gè)濃度通常是在反應(yīng)體系中達(dá)到250nmol/L。但我們不能無限制的添加探針,這會(huì)增加成本,尤其是大批量檢測時(shí),我們需要減少生產(chǎn)試劑的成本。


    實(shí)際探索優(yōu)化中,對(duì)Taqman探針法為原理的實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),我們也可以使用SYBR Green I法對(duì)引物濃度進(jìn)行測試,因?yàn)镾YBR  Green I染料能與任意雙鏈DNA結(jié)合,可以檢測到產(chǎn)生的引物二聚體和其他非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的量。引物二聚體會(huì)降低擴(kuò)增效率和特異性,我們希望找到合適的引物濃度,減少二聚體、非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。


    綜上,我們需要尋找引物和探針的*濃度,保證反應(yīng)的靈敏度的同時(shí),降低成本,并獲得最大特異性。


    在實(shí)踐中,我們通常推薦這樣的方法來進(jìn)行優(yōu)化:

    1、優(yōu)化引物濃度時(shí)從一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的濃度開始優(yōu)化,每次調(diào)整濃度后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,通過分析標(biāo)準(zhǔn)曲線圖判斷優(yōu)化效果。推薦的標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化濃度:Taqman探針法終濃度是500nmol/L,SYBR Green I法是200~400nmol/L。


    2、引物濃度效果評(píng)判的標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)曲線是線性的,且效率>80%,可以認(rèn)為濃度是合適的,就不需要進(jìn)一步優(yōu)化了。


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