實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化（四）

這期我們來(lái)學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)TaqMan探針，應(yīng)該考慮的因素有以下這些......

1、TaqMan探針的最佳長(zhǎng)度在20bp，不超過(guò)30bp，這樣才能實(shí)現(xiàn)熒光淬滅。有些情況下超過(guò)30bp也是可以的，需要將淬滅基團(tuán)設(shè)計(jì)在距離5'端18～25bp的地方。

2、TaqMan探針的Tm值要比引物的高10°C，通常在65～70°C之間，確保探針比引物先結(jié)合在模板上。

3、探針序列應(yīng)該避免連續(xù)的單堿基重復(fù)序列，尤其是G，因?yàn)檫@可能影響探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)，降低雜交效率。

只能使用這種單堿基重復(fù)序列時(shí)，可通過(guò)肌苷替代鳥(niǎo)嘌呤，中斷連續(xù)。

如果是5'端有太多鳥(niǎo)嘌呤，也會(huì)產(chǎn)生不好影響，淬滅探針的熒光。

4、TaqMan探針的GC含量應(yīng)該在50%。

5、探針5'端應(yīng)該盡可能與3'端相似，保證Taq酶快速降解探針。

6、制備好的探針應(yīng)采用HPLC純化