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    盤點(diǎn)RACE技術(shù)的幾種類型及特點(diǎn)

    發(fā)布時(shí)間: 2021-09-16  點(diǎn)擊次數(shù): 3117次

    在分子生物學(xué)中,未知基因全長(zhǎng)序列的獲取是研究新基因的重要步驟。當(dāng)我們不清楚目的基因的完整序列時(shí),獲得未知序列的方法有反向PCR、mRNA差異顯示技術(shù)、基因組減法技術(shù)以及cDNA文庫篩選技術(shù)等等......


    背景介紹

    今天我們來一起了解一種可從低豐度轉(zhuǎn)錄本中獲得cDNA末端序列的方法—RACE技術(shù)。當(dāng)我們不清楚目的基因的完整序列,只知道其中的一段序列時(shí),就可以通過RACE技術(shù)獲得mRNA兩端序列,再與已知序列拼接,從而得到完整mRNA序列。相比其他獲得mRNA全長(zhǎng)的技術(shù),RACE具有簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)的優(yōu)勢(shì),因而得到較多的運(yùn)用。


    RACE是什么?

    RACE全稱為rapid amplification of cDNA end,即cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù),就是已知部分cDNA序列,基于mRNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)獲得完整的cDNA的 3'或5'末端的分子生物學(xué)技術(shù)。


    RACE可以應(yīng)用在哪些實(shí)驗(yàn)方向?

    構(gòu)建cDNA文庫

    lncRNA全長(zhǎng)克隆

    獲得抗體可變區(qū)序列

    miRNA靶基因序列驗(yàn)證

    已知基因一段序列,克隆旁側(cè)序列

    獲得病毒基因組

    ......

    總體來說,就是用來測(cè)定cDNA序列,獲得RNA全長(zhǎng)序列。


    RACE技術(shù)類型及特點(diǎn)?

    RACE技術(shù)有多種類型,根據(jù)各個(gè)RACE技術(shù)原理的不同,適合于不同的RNA,快來跟著小編一起來了解下吧~

    經(jīng)典RACE

    經(jīng)典RACE技術(shù)是在1988年由Frohman等[1]發(fā)明。經(jīng)典RACE技術(shù)包括5'RACE和3'RACE,分別克隆cDNA的5'端和3'端。


    盤點(diǎn)RACE技術(shù)的幾種類型及特點(diǎn)

    1. 3'RACE利用真核生物mRNA 3'端具有poly A結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),使用5'端帶有接頭序列的oligo dT與之結(jié)合進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA;

    2. 再利用根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的上游引物和與接頭序列互補(bǔ)配對(duì)的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到cDNA 3'末端擴(kuò)增產(chǎn)物。

    盤點(diǎn)RACE技術(shù)的幾種類型及特點(diǎn)

    1. 經(jīng)典RACE技術(shù)中的5'RACE是利用根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的下游引物GSP作為逆轉(zhuǎn)錄引物,合成一鏈cDNA;

    2. 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在新合成的cDNA 3'末端加上poly A;

    3. 帶有接頭序列的Oligo dT引物與一鏈cDNA 3'末端的poly A結(jié)合,合成二鏈cDNA;

    4. 再以第二鏈cDNA為模板,利用GSP和接頭引物作為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到cDNA 5'末端擴(kuò)增產(chǎn)物;

    得到的5'末端產(chǎn)物和3’末端產(chǎn)物可以通過克隆連接到適當(dāng)?shù)妮d體上,進(jìn)行測(cè)序獲得末端序列。將測(cè)序得到的cDNA末端序列,與已知的中間序列進(jìn)行拼接,就可獲得cDNA全長(zhǎng)序列。


    經(jīng)過科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,由經(jīng)典RACE又衍生出多種RACE技術(shù),增加了RACE技術(shù)的適用廣泛性,我們?cè)賮硪黄鹆私庀缕渌腞ACE技術(shù)吧!

    Cap-switching RACE

    Cap-switching RACE針對(duì)mRNA發(fā)生斷裂的可能,進(jìn)行了技術(shù)優(yōu)化[2-4]。


    盤點(diǎn)RACE技術(shù)的幾種類型及特點(diǎn)

    1. Cap-switching RACE是以O(shè)ligo dT作為逆轉(zhuǎn)錄引物,逆轉(zhuǎn)錄獲得一鏈cDNA;

    2. 當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄到mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)時(shí),莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)會(huì)在新合成的cDNA的3'末端加上若干個(gè)胞嘧啶;

    3. 接著,使用5'端帶有接頭、3'端帶有poly G結(jié)構(gòu)的接頭引物與cDNA 3'端的poly C互補(bǔ)配對(duì),逆轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)以接頭為模板合成cDNA,完成接頭轉(zhuǎn)化,新合成的一鏈cDNA 3'端就含有一段接頭序列;

    4. 然后再利用接頭引物進(jìn)行PCR獲得RACE產(chǎn)物。

    RLM-RACE

    RLM-RACE技術(shù)的出現(xiàn)同樣也是為了擴(kuò)增到完整mRNA的5'末端,避免mRNA斷裂帶來的影響。


    盤點(diǎn)RACE技術(shù)的幾種類型及特點(diǎn)

    1. 首先在RNA體系中加入牛小腸堿性磷酸酶(CAP),特異性地識(shí)別并切除斷裂mRNA 5'端暴露的磷酸基團(tuán);

    2. 再向體系中加入煙草酸焦磷酸酶(TAP),切除mRNA 5'端完整的帽子結(jié)構(gòu),使mRNA 5'端暴露出一個(gè)磷酸基團(tuán);

    3. 接著加入RNA連接酶將接頭與mRNA 5'端暴露的磷酸基團(tuán)連接,而切除了磷酸基團(tuán)的斷裂RNA則不能與接頭結(jié)合,這樣便獲得了5'端帶有接頭的完整mRNA;

    4. 最后再進(jìn)行RT-PCR。

    Adapter-Ligated RACE

    Adapter-Ligated RACE技術(shù)同樣是為了獲得更長(zhǎng)的mRNA序列,但相對(duì)來說不一定能獲得全長(zhǎng)mRNA序列[5]。


    盤點(diǎn)RACE技術(shù)的幾種類型及特點(diǎn)

    1. 向逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA體系中加入T4連接酶,利用T4連接酶將接頭連接到cDNA兩個(gè)末端上;

    2. 短cDNA的退火溫度低,兩端接頭容易發(fā)生退火,形成鍋柄狀結(jié)構(gòu);

    3. 長(zhǎng)的cDNA退火溫度高,不易形成鍋柄裝結(jié)構(gòu),因此引物可以與接頭結(jié)合,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。


    環(huán)形-RACE

    環(huán)形-RACE使用一對(duì)基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,提高了PCR擴(kuò)增的特異性[6]。

    1. 環(huán)形RACE是利用T4連接酶將cDNA的末端連接,形成cDNA的環(huán)化結(jié)構(gòu)或串聯(lián)結(jié)構(gòu);

    2. 根據(jù)mRNA上的已知區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物GSP,以GSP引物合成第二條cDNA鏈;

    3. 在未知序列兩端根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)一對(duì)GSP進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將未知序列置換到已知序列中間位置,得到中間是未知序列、兩端是已知序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。



    RCA-RACE

    RCA-RACE (rolling circle amplification rapid amplification of cDNA ends)類似于環(huán)形RACE,但是RCA-RACE在環(huán)化的過程中并不會(huì)產(chǎn)生串聯(lián)結(jié)構(gòu),PCR擴(kuò)增過程中所使用的引物既可以是特異性引物,也可以是隨機(jī)引物。PCR擴(kuò)增使用φ29聚合酶,這種酶的特點(diǎn)是會(huì)把酶前行方向上的前鏈從原來的模板鏈上進(jìn)行解鏈、移開。RCA-RACE利用這種特點(diǎn),可以讓模板上的每個(gè)點(diǎn)在第一輪反應(yīng)中,都有機(jī)會(huì)得到n個(gè)拷貝,產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增。

    RCA-RACE利用ATP依賴性的熱穩(wěn)定連接酶,將一條cDNA末端的5'磷酸基團(tuán)和3'羥基連接,形成單分子環(huán)狀DNA。再使用隨機(jī)引物或基因特異性引物,在φ29 DNA聚合酶的催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物呈指數(shù)增長(zhǎng)。


    RACE的技術(shù)特點(diǎn)對(duì)比

    盤點(diǎn)RACE技術(shù)的幾種類型及特點(diǎn)

    基于RACE技術(shù)原理,以下幾點(diǎn)可提高RACE實(shí)驗(yàn)的成功率:

    1. 保證RNA模板的完整性。實(shí)驗(yàn)之前最好進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA完整性。

    2. 使用高特異性引物。如使用Vazyme的RACE引物設(shè)計(jì)軟件,軟件會(huì)給出多條合適的RACE引物,可選擇多條基因特異性引物進(jìn)行RACE實(shí)驗(yàn),提高成功率。


    3.巢式PCR。應(yīng)用巢式PCR設(shè)計(jì)引物時(shí),在引物中加入特異性序列和適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn),一方面可以增加對(duì)目的片段的特異性克隆,另一方面也方便后續(xù)的測(cè)序和實(shí)驗(yàn)


    安培可以提供

    HiScript-TS 5'/3' RACE Kit(Vazyme #RA101)基于Cap-switching RACE原理開發(fā),試劑盒中包括5'RACE和3'RACE的所有組分,可分別獲得5'RACE和3'RACE的產(chǎn)物。

    原理圖如下:


    盤點(diǎn)RACE技術(shù)的幾種類型及特點(diǎn)

    成功率高:經(jīng)測(cè)試RA101陽性率可達(dá)到70 %以上

    操作流程簡(jiǎn)便、體驗(yàn)感優(yōu):步驟簡(jiǎn)化,一管內(nèi)完成模板轉(zhuǎn)換和一鏈cDNA合成;組分Mix形式,減少加樣步驟、降低加樣所帶來的污染

    配套R(shí)ACE引物設(shè)計(jì)軟件和序列比對(duì)軟件:包含RACE實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)軟件和序列比對(duì)軟件,以及使用說明文件,簡(jiǎn)化RACE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)環(huán)節(jié)


    【參考文獻(xiàn)】

    [1] Frohman M A,Dush M K,Martin G R. Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide prime[J]. Proc. Nat. Acad. Sci. USA,1988,85( 23) : 8998 - 9002.

    [2] Matz M,Shagin D,Bogdanova E,et al. . Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR[J]. Nucl. Acid Res. ,1999,27( 6) : 1558 - 1560.

    [3] Schramm G,Bruchhaus I,Roeder T. A simple and reliable 5- RACE approach[J]. Nucl. Acid Res. ,2000,28( 22) : e96.

    [4] Schmidt W M,Mueller M W. CapSelect: a highly sensitive method for 5'CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs[J]. Nucl. Acid Res. , 1999,27( 21) : e31.

    [5] Chenchik A,Diachenko L,Moqadam F,et al. . Full-length cDNA cloning and determination of mRNA 5' and 3' ends by amplification of adaptor-ligated cDNA[J]. Biotechniques, 1996,21( 3) : 526 - 535.

    [6] Maruyama I N,Rakow T L,Maruyama H I. cRACE: a simple method for identification of the 5' end of mRNAs[J]. Nucl. Acid Res. ,1995,23( 18) : 3796 - 3797.

    [7] 徐燁, 劉雅婷, 代文瓊,等. 幾種主要的RACE技術(shù)及應(yīng)用 [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2012, 014(002):81-87.



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