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搞定內(nèi)參,駕馭 Western blot 已成功一半
發(fā)布時間: 2021-09-15 點擊次數(shù): 1052次western blot 對絕大多數(shù)實驗新人而言,絕對是心中痛,一碰就要抓狂。沒辦法,誰讓導(dǎo)師發(fā)話了,WB 做不好,延畢就是分分鐘的事兒。這還真是讓小伙伴們感嘆道,WB 想說愛你不容易。那么為了*馴服 WB,獲得漂亮且理想的實驗結(jié)果,一個良好的參照體系就絕對是*的存在。
一般而言,良好的參照體系包括:
*體重計(分子量 marker):可確定蛋白條帶對應(yīng)的分子量大小
*光桿司令(空白對照):不加一抗和二抗,用于檢測膜的性質(zhì)的封閉效果
*好榜樣(陽性對照):已知量標(biāo)準產(chǎn)物的正對照,可檢測抗體的工作效率
*打醬油的(陰性對照):不表達靶蛋白的組織或樣品,檢測抗體的特異性
*單飛者(二抗對照):不加一抗,檢測二抗的特異性。
*校正者(內(nèi)參對照):檢測標(biāo)本系統(tǒng)和抗體系統(tǒng),減少蛋白定量、上樣過程中的誤差
內(nèi)參君的初次登場
在此,小編就帶領(lǐng)大家一起來認識認知這位“有名"的內(nèi)參君吧。內(nèi)參(Internal Control),簡而言之,一般指的是由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins),因其表達恒定被用于檢測蛋白表達水平變化時的參照物,可確保實驗結(jié)果的準確性。
Tips:
1)在一些文獻報道中,Erk2、TATA bindingprotein(TBP)以及 c-Jun、c-Fos 等也可被用于核蛋白的內(nèi)參。
2)內(nèi)參的選擇需要考慮實際的實驗環(huán)境。
eg:在細胞增殖相關(guān)試驗中,c-Jun 由于自身表達變化就不適合做內(nèi)參;而在凋亡實驗時,TBP、Lamin 等也不適合作為內(nèi)參。因此設(shè)計實驗方案的時候應(yīng)該考慮這些因素并查詢相應(yīng)文獻,在實驗過程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達出現(xiàn)異常,應(yīng)考慮這方面因素。
鋒芒畢露的內(nèi)參君
正所謂,養(yǎng)兵千日,用在一時。可是很多實驗菜鳥在選好內(nèi)參之后,對下一步如何發(fā)揮內(nèi)參君的本領(lǐng)感到一愁莫展。那么以下三個妙招可一解大家的燃眉之急。
1、超級簡便的標(biāo)記內(nèi)參使用法:只要在二抗孵育時加入 HRP 標(biāo)記內(nèi)參抗體,按照正常操作即可。
2 、普通內(nèi)參:當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時,可以*行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用膜再生液(P1650)洗掉膜上的抗體,重新進行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。
3 、當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下,可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染,根據(jù)蛋白質(zhì) Marker 的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分,使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育,二抗溫育以及顯色。 如此下來,各位小伙伴就可以坐等鋒芒畢露的內(nèi)參君為我們擒獲漂亮且理想的內(nèi)參圖片。
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