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分享總結(jié)Western跑磷酸化蛋白的要點(diǎn)
發(fā)布時(shí)間: 2021-09-17 點(diǎn)擊次數(shù): 2910次抗體
工欲善其事必先利其器,抗體很關(guān)鍵。這里我們要說的并不是最貴的就是好的,如果條件允許,建議同時(shí)購買不同廠家的抗體,一起來試一試,因?yàn)橛袝r(shí)候即使是好的品牌,不同批次穩(wěn)定性也不一樣??贵w從訂購到到貨有一定的時(shí)間,所以到貨后請(qǐng)盡快分裝好,準(zhǔn)備做實(shí)驗(yàn),如果實(shí)驗(yàn)進(jìn)度跟不上的問題,導(dǎo)致抗體到了后拖了很久才正式實(shí)驗(yàn),這樣拖了時(shí)間找廠家售后申訴也是很被動(dòng)的。用 CST 的一抗,效果不穩(wěn)定,也可能跟抗體放久了有關(guān)。最后買了另一家代理的抗體算是有了比較穩(wěn)定的結(jié)果。當(dāng)然,還是選擇購買口碑較好的公司的產(chǎn)品為佳,這樣即使出了問題售后也會(huì)跟進(jìn)。如果經(jīng)費(fèi)有限,可以買買小包裝的產(chǎn)品先試試,不少抗體公司還有 5ul 的抗體試用裝免費(fèi)申請(qǐng)。再者,孵育一抗的時(shí)候,建議用新鮮抗體,什么意思呢?很多同學(xué)因?yàn)橄雸D省事兒,很多時(shí)候配好孵育液,每次孵育好之后再次放進(jìn)冰箱等待下次重復(fù)利用,一些比較好跑的蛋白到時(shí)沒啥問題,但是磷酸化的蛋白建議每次都用新鮮的抗體原液,將條帶剪下來后用雜交袋塑封 好,按 1:1000 的比例加入抗體原液孵育,再這種情況下,100ul 的抗體也是能用很久的,所以盡量每次都用新的抗體。
蛋白上樣
普遍反映磷酸化的條帶很淡,有時(shí)候達(dá)不到制圖標(biāo)準(zhǔn),這點(diǎn)可以加大上樣量來解決,另外,磷酸化蛋白一般與非磷酸化的蛋白一起跑一起制圖,它本來就是要比非磷酸化的要淡一些,不要過分擔(dān)心。
電泳
不同 kb 的蛋白電泳時(shí)間有所差別,參數(shù)啥的要用腦子更改,不能一成不變,避免發(fā)生那種蛋白跑不見了的慘劇。
封閉
這個(gè)步驟非常重要,強(qiáng)推 BSA 封閉,不要用脫脂奶粉封閉,BSA 封閉對(duì)磷酸化的抗體效果非常好,而且也不貴。另外,BSA 封閉液倒是可以反復(fù)使用不至于向奶粉一樣臭掉,用來孵育一般非磷酸化的抗體,效果同樣棒棒噠! 再者,封閉時(shí)間可以延長(zhǎng),一般封閉 2-3 小時(shí)的情況下,可以封閉延時(shí)到 4 小時(shí),所以按照從早到晚做實(shí)驗(yàn)的時(shí)間,用 BSA 配好封閉液開始封閉的時(shí)候,您就可以慢慢的約個(gè)火鍋唱個(gè)歌再回來了,實(shí)驗(yàn)本來就很辛苦,不要再依賴外賣小哥了。
洗膜
嚴(yán)格遵守洗膜時(shí)間,不得減少次數(shù),每個(gè)步驟洗 3 次,每次可以洗長(zhǎng)一點(diǎn),比如(11-12 分鐘)。
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