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CO-IP實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)
發(fā)布時(shí)間: 2024-01-16 點(diǎn)擊次數(shù): 480次原理:
CO-IP(免疫共沉淀)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。
從原理示意圖可見,免疫共沉淀利用抗原(紅三角)與蛋白 (藍(lán)圓柱) 的特異性結(jié)合,再通過連接著樹脂的抗體 (紫圓球) 去識(shí)別抗原,從細(xì)胞裂解液或者蛋白混合物中捕獲與抗原相作的蛋白。之后通過進(jìn)一步洗脫,獲取抗原-蛋白復(fù)合物,再對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
一、蛋白樣品制備
裂解提取出免疫沉淀需要的蛋白樣品,以下為HEK293T細(xì)胞樣品的處理方法,其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。
單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取:
1、收集細(xì)胞:10cm細(xì)胞培養(yǎng)板上,每板細(xì)胞加1ml ,4℃預(yù)冷的PBS(0.01 M pH7.2~7.3)。反復(fù)沖洗把所有掛壁細(xì)胞洗下來轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管內(nèi) 離心:3400 rpm 2min。
2、清洗細(xì)胞:棄上清,(大槍頭套小槍頭)避免吸到沉淀。再加1mPBS,垂懸吹打;離心:rpm3400 2min。棄上清,將PBS吸凈后-80℃保存。
3、準(zhǔn)備Protein A agarose,用PBS 洗兩遍珠子,然后用PBS配制成50%濃度,建議減掉槍尖部分,避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。
4、裂解蛋白,收集的細(xì)胞中加入1000ul細(xì)胞裂解液10ul蛋白酶抑制劑,冰上靜置30min,每10min震蕩混勻一次,4℃,12000rpm離心10min,收集上清液。
5、 每1 ml 總蛋白中加入100 μl Protein A瓊脂糖珠(50%),4℃搖晃1 h以去除非特異性雜蛋白,降低背景。
6、4℃,14000g離心15min,將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中標(biāo)號(hào)Input,留Protein A珠子,標(biāo)號(hào)IP。
7、變性以及還原蛋白
室溫溶解蛋白上樣緩沖液(5×),按照4 uL蛋白樣品+1 ul (5×)的比例混合,IP組加入50ul蛋白上樣緩沖液,在蛋白樣品中加入含SDS(保證樣品中的所有蛋白帶電荷一致)的上樣緩沖液,100℃加熱煮沸,以充分變性蛋白。冰上驟冷,上樣到SDS-PAGE膠加樣孔即可。
二、經(jīng)過SDS-PAGE分離樣品
膠的選擇與制備(根據(jù)目的蛋白的大小,選擇合適的分離膠的濃度)
1、凝膠的制備:根據(jù)目的蛋白的大小來選擇合適濃度的分離膠。目的蛋白小于20 k Da選擇12%~15%的分離膠;大于20 k Da選擇10%的分離膠, 濃縮膠一般固定為5%。
2、上樣加入蛋白樣品,每孔加上樣液20ug,留一孔加預(yù)染的marker。
3、加滿電泳緩沖液,蓋上槽蓋,接通電源,先用70V恒壓電泳,約30min,當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改用90V恒壓電泳,當(dāng)指示劑到達(dá)距凝膠下端約0.5cm處時(shí)關(guān)閉電源,取出膠板。
(注意:上樣時(shí)間盡量短,避免樣品擴(kuò)散,但也不能過快避免樣品溢出而造成相鄰加樣孔的交叉污染,未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液)
三、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育
將蛋白凝膠中的蛋白,通過電流作用轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)印膜上。
1、將剪好的PVDF膜用無水甲醇潤濕30秒以上,然后用dd H2O漂洗2min,浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中5min后開始后續(xù)操作。
2、裝配轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)(在轉(zhuǎn)移緩沖液中制備三明治可以避免氣泡的產(chǎn)生)
黑面(負(fù)極)→海綿墊→3層濾紙→凝膠→轉(zhuǎn)印膜→3層濾紙→海綿墊→紅面(正極),每層之間不能有氣泡。然后將三明治轉(zhuǎn)移至電泳槽中,黑面對(duì)黑面。
3、加入轉(zhuǎn)膜緩沖液,將電轉(zhuǎn)儀置于冰水中,300mA恒流轉(zhuǎn)膜60-90min。
4、轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,使用5% 脫脂奶粉室溫封閉1h。
5、選擇合適的一抗孵育,室溫?fù)u動(dòng)1h。
6、孵育二抗,4℃孵育2h或室溫(22-25℃)搖動(dòng)孵育1h。(抗體查相應(yīng)說明書確定稀釋倍數(shù))
四、顯影
1、配置稀釋液,將A液和B液按照(1:1)混合。
2、從TBST緩沖液中取出膜,去除膜上的多余緩沖液,但不要讓膜干燥。
3、將有蛋白的一面朝上平整的鋪在一張紙板上,加上配好的工作稀釋液。用量以覆蓋住膜為基準(zhǔn)。
4、將膜與工作稀釋液孵育1-5min,確保整個(gè)表面覆蓋。
5、去除多余的液體,用保鮮膜包好PVDF膜,暗室中X膠片感光顯影定影。
注意:
1、一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。
2、顯色液必須新鮮配置使用,最后加入 H2O2。
3、DAB 有致癌的潛在可能,操作時(shí)要小心仔細(xì)。
五、注意事項(xiàng)
1、上樣時(shí),要迅速,避免樣品擴(kuò)散,也不能讓樣品溢出而造成相鄰加樣孔的交叉污染。
2、全程操作中戴手套,不要用手觸膜。
3、如檢測(cè)小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2µm的膜,并可省略轉(zhuǎn)移時(shí)的平衡步驟。
4、 某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫,此時(shí)可用1.0% BSA代替Tween-20。
5、如要同時(shí)檢測(cè)大分子量和小分子蛋白,最好用梯度膠分離蛋白。
6、曝光時(shí)。去除膜上的多余緩沖液,但不要讓膜干燥,顯影液要現(xiàn)用現(xiàn)配。
7、PVDF 膜上一抗二抗可以使用洗脫液洗脫,重新孵育一抗二抗。
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