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    分光光度法測(cè)定葉綠素含量

    發(fā)布時(shí)間: 2023-01-16  點(diǎn)擊次數(shù): 887次

    原理

    葉綠素廣泛存在于果蔬等綠色植物組織中,并在植物細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成葉綠體。當(dāng)植物細(xì)胞死亡后,葉綠素即游離出來,游離葉綠素很不穩(wěn)定,對(duì)光、熱較敏感;在酸性條件下葉綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素,在稀堿液中可水解成鮮綠色的葉綠酸鹽以及葉綠醇和甲醇。高等植物中葉綠素有兩種:葉綠素a 和b,兩者均易溶于乙醇、乙-醚、丙酮和氯仿。

     

    葉綠素的含量測(cè)定方法有多種,其中主要有:

     

    1.原子吸收光譜法:通過測(cè)定鎂元素的含量,進(jìn)而間接計(jì)算葉綠素的含量。

     

    2.分光光度法:利用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素提取液在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光值,即可用朗伯—比爾定律計(jì)算出提取液中各色素的含量。

     

    葉綠素a 和葉綠素b 在645nm 和663nm 處有最大吸收,且兩吸收曲線相交于652nm 處。因此測(cè)定提取液在645nm、663nm、652nm 波長(zhǎng)下的吸光值,并根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式可分別計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。

    材料與儀器

    植物材料
    96%乙醇 丙酮 石英砂 碳酸鈣粉
    分光光度計(jì) 電子頂載天平 研缽 棕色容量瓶 定量濾紙 吸水紙 擦境紙 滴管 漏斗

    步驟

    1.取新鮮植物葉片(或其它綠色組織)或干材料,擦凈組織表面污物,去除中脈剪碎。稱取剪碎的新鮮樣品2g,放入研缽中,加少量石英砂和碳酸鈣粉及3mL95%乙醇,研成均漿,再加乙醇10mL,繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3——5min。

     

    2.取濾紙1張置于漏斗中,用乙醇濕潤(rùn),沿玻棒把提取液倒入漏斗,濾液流至100mL 棕色容量瓶中;用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次,最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?/p>

     

    3.用滴管吸取乙醇,將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o綠色為止。最后用乙醇定容至100mL,搖勻。

     

    4.取葉綠體色素提取液在波長(zhǎng)665nm、645nm 和652nm 下測(cè)定吸光度,以95%乙醇為空白對(duì)照。

    注意事項(xiàng)

    1.光對(duì)葉綠素有破壞作用,實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在弱光下進(jìn)行,且應(yīng)盡量在短時(shí)間內(nèi)研磨。

     

    2.色素提取液若混有其他物質(zhì)而造成渾濁,將影響吸光度的測(cè)定,應(yīng)重新過濾或離心。

     

    3.色素吸光度測(cè)定前,應(yīng)按儀器說明及標(biāo)準(zhǔn)葉綠素 a 、 b 對(duì)分光光度計(jì)的波長(zhǎng)進(jìn)行校正,否則影響葉綠素含量的測(cè)定精度。

    常見問題

    1.無水乙醇提取時(shí)間較長(zhǎng)且對(duì)某些材料特別是木本植物的葉綠素提取不夠完-全。無水丙酮提取會(huì)出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象,影響比色測(cè)定。因此選用丙酮和無水乙醇混合提取葉綠素的效果較好,比列以2:1效果較佳。

     

    2.傳統(tǒng)的80%丙酮法由于含水量過高,造成葉綠素穩(wěn)定性差,提取速度慢,測(cè)定值偏低,應(yīng)慎重采用。


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