銷售熱線

19126518388
  • 技術(shù)文章ARTICLE

    您當(dāng)前的位置:首頁(yè) > 技術(shù)文章 > cDNA 3'末端的快速擴(kuò)增(3’-RACE)

    cDNA 3'末端的快速擴(kuò)增(3’-RACE)

    發(fā)布時(shí)間: 2021-12-21  點(diǎn)擊次數(shù): 1181次

    原理

    在用 oligo (dT) 引物構(gòu)建的 cDNA 文庫(kù)中,偶而發(fā)生部分 cDNA 克隆缺失了與靶 mRNA 3' 末端互補(bǔ)的序列。這部分序列到底是在 cDNA 合成過(guò)程中還是在分子克隆中怎樣缺失和在哪個(gè)環(huán)節(jié)中缺失的尚不清楚。第一鏈 cDNA 的隨機(jī)斷裂,在合成第二鏈 cDNA 過(guò)程中 DNA 聚合酶不能抵達(dá)模板鏈的末端,引導(dǎo)序列內(nèi)部的 poly (A) 序列或在分子克隆過(guò)程中 poly (dA:dT) 序列附近的 3' 序列的缺失等都是可能造成 3' 末端序列缺失的原因。在用隨機(jī)六核苷酸引物構(gòu)建的 cDNA 基因文庫(kù)中,也存在部分的 cDNA 克隆缺失了 3' 末端序列,這是因?yàn)檫@種隨機(jī)引物能與靶 mRNA 的許多位點(diǎn)復(fù)性結(jié)合所致。

    材料與儀器

    反轉(zhuǎn)錄酶 反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶 接頭引物 基因特異性反義寡核苷酸引物 總 RNA
    擴(kuò)增緩沖液 氯仿 dNTP 貯存液 胎盤 RNase 抑制劑 TE
    瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠 屏蔽型槍頭 微量離心管 正向排液式移液器 PCR 儀 水浴箱

    步驟

    一、材料

    1. 緩沖液與溶液

    10X 擴(kuò)增緩沖液

    氯仿

    4 種 dNTP 貯存液(20 mmol/L,pH 8.0)

    胎盤 RNase 抑制劑(20 單位/μl)

    TE ( pH 7.6)

    2. 酶與緩沖液

    反轉(zhuǎn)錄酶(RNA 依賴的 DNA 聚合酶)

    5X 反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液

    熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶

    3. 凝膠

    瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠

    4. 核苷酸與寡核苷酸

    接頭引物(10 μmol/L, 5' GACTCGAGTCGACATCG3' ) 溶于水中(10 pmol/μl)

    (接頭引物可以與基因特異性正向引物聯(lián)合在一起用于擴(kuò)增特異性靶 cDNA。第一步 PCR 擴(kuò)增后,PCR 目的產(chǎn)物可能僅占總 DNA 產(chǎn)物的 1%,也可能多至占總 DNA 產(chǎn)物的 100%。如果必要,可用第一輪 PCR 產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二輪嵌套式 PCR,改善目的產(chǎn)物的產(chǎn)率,該輪 PCR 的引物為接頭引物與另一個(gè)基因特異性正向引物。在第二輪嵌套式 PCR 擴(kuò)增后,幾乎所有的擴(kuò)增產(chǎn)物在 EB 染色下呈現(xiàn)了靶 mRNA 的 5' 區(qū)域序列相一致的條帶。

    RT-PCR 的引物用自動(dòng) DNA 合成儀合成,用于標(biāo)準(zhǔn) RT-PCR的引物一般不需要進(jìn)一步純化。然而,如果寡核苷酸引物經(jīng)商品化的樹脂進(jìn)行柱層析純化(如 NENLife- Science 公司產(chǎn)品 NENSORB)或者經(jīng)變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化,純化后的引物用于擴(kuò)增低豐度的 mRNA 時(shí)常常會(huì)更有效。)

    (dT)17-接頭引物(10 μmol/L,5'GACTCGAGTCGACATCGA(T)173')溶于水中(10 pmol/μl)

    基因特異性反義寡核苷酸引物(10 μmol/L) 溶于水(10 pmol/μl)。

    (基因特異性反義寡核苷酸引物應(yīng)該與靶 mRNA 的已知序列互補(bǔ),其長(zhǎng)度在 20~ 30 bp,內(nèi)含的 4 種堿基數(shù)量基本相等,G 與 C堿基的平衡分布以及引物具有較低的自發(fā)形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向。)

    總 RNA(100 μg/ml)或 poly (A)+ RNA(10 μg/ml)溶于水中

    (總 RNA一般用離液劑(chaotropic agents) 從細(xì)胞中抽提的,選擇總 RNA 作模板一般適用于從中等程度到高豐度 mRNA 中通過(guò) RT-PCR 克隆靶基因。對(duì)于低豐度靶 mRNA 的樣品最好選擇 poly (A) + RNA 作模板進(jìn)行 RT-PCR。運(yùn)用作為 RT-PCR 模板的 RNA 也可以從如下的少量培養(yǎng)細(xì)胞中制備。)

    5. 特殊設(shè)備

    自動(dòng)微量移液器的屏蔽型槍頭

    微量離心管(0.5 ml,薄壁擴(kuò)增反應(yīng)專用離心管)或微量滴定板

    正向排液式移液器

    PCR 儀

    水浴箱預(yù)設(shè)水溫在 75℃

    二、方法

    反轉(zhuǎn)錄

    在實(shí)驗(yàn)開始時(shí),首先要確定 3'-RACE 是否成功。如果反轉(zhuǎn)錄步驟是有效的,那么分離到含有靶 mRNA 的 3' 末端序列的克隆的幾率是高的。另一方面,如果反轉(zhuǎn)錄步驟是無(wú)效的,那么本方案的后續(xù)步驟是無(wú)法彌補(bǔ)的。因此,對(duì)于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件是值得花時(shí)間優(yōu)化的,如最佳的引物與模板比例,改變反應(yīng)體系 Mg2+ 濃度,尋找最適的 Mg2+ 濃度。

    1. 轉(zhuǎn)染 1 pg 至 100 ng 的 poly (A)+ RNA 或 1 μg 總 RNA 到一只新的離心管。用水調(diào)整體積至 10 μl。將 RNA 樣品在 75℃ 變性 5 min,將離心管迅速插入冰中冷卻。

    2. 向含有這種變性的 RNA 樣品的離心管內(nèi)依次加入如下試劑:

    5X 反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液                              10 μl

    20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液               1.5 μl

    10 μmol/L (dT)17-接頭引物(80 pmol)  8 μl

    約 20 單位/μl 胎盤 RNase 抑制劑          1 μl

    100~200 單位/μl 反轉(zhuǎn)錄酶                    1 μl

    H2O 補(bǔ)足至                                         50 μl

    反應(yīng)管溫育在 37℃ 反應(yīng) 60 min。設(shè)置 3 支陰性對(duì)照管。在一支對(duì)照管中加入合成第一鏈 cDNA 反應(yīng)所需的所有試劑,但不加模板 RNA;第二支對(duì)照管加入除了反轉(zhuǎn)錄酶外的所有試劑;第三支對(duì)照管中加入除引物外的所有試劑。這些對(duì)照管進(jìn)行所有的后續(xù)步驟。設(shè)置這些對(duì)照管能保證 cDNA 產(chǎn)物的不是由于污染或由 RNA 的自身引導(dǎo)所致。

    3. 用 TE ( pH 7.6 ) 將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物(cDNA ) 稀釋至終體積為 1 ml。

    擴(kuò)增

    4. 按以下次序,將各成分加入到一只 0.5 ml 滅菌離心管、擴(kuò)增管或滅菌微量滴定板的孔內(nèi),建立 PCR 系列反應(yīng)管:

    已稀釋 cDNA                                                             0~20 μl

    10X 擴(kuò)增緩沖液                                                          5 μl

    20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液                                      5 μl

    10 μmol/L (dT)17-接頭引物(16 pmol)                        1.6 μl

    10 μmol/L 接頭引物(32 pmol)                                  3.2 μl

    10 μmol/L 基因特異性正義寡聚核苷酸引物(32 pmol)  3.2 μl

    1~2 單位熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶                                       1 μl

    H2O 補(bǔ)足至                                                                50 μl

    如果實(shí)驗(yàn)必要,可建立系列的擴(kuò)增試驗(yàn)管,用于篩選 cDNA 產(chǎn)生最大量的 3' 末端擴(kuò)增產(chǎn)物的試驗(yàn)管。對(duì)照管加入以上除了 cDNA 模板之外的所有試劑,以鑒別模板有無(wú)污染。

    5. 如果 PCR 儀沒有配置加熱蓋,在反應(yīng)混合液的上層應(yīng)加一滴礦物油(約 50 μl),防止樣品在 PCR 反應(yīng)多個(gè)加熱與冷卻的循環(huán)過(guò)程中蒸發(fā);如果應(yīng)用熱啟動(dòng) PCR 程序, 在反應(yīng)混合液上層加一滴石蠟油;放置離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。擴(kuò)增核苷酸的典型程序有變性、復(fù)性和聚合(延伸反應(yīng));相應(yīng)的循環(huán)條件與溫度列表如下:

    6. 抽取每種擴(kuò)增樣品 5~10 μl,用瓊脂凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)分析擴(kuò)增結(jié)果,用判斷擴(kuò)增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠)或 SYBR 金顆粒染色后來(lái)觀察擴(kuò)增的量與片段大小。

    7. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內(nèi)樣品液體的上層,反應(yīng)結(jié)束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

    8. 從擴(kuò)增的 DNA 產(chǎn)物中分離掉殘余的熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶和 dNTP。

    以上就是本期的內(nèi)容,更多資訊,歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。


    安培生物科技有限公司介紹:

    安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究、活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶,提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑;inviCELL™Platelet lysate無(wú)動(dòng)物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn),包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等,為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù);提供以植物生物為平臺(tái)基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品;提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù),努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。


產(chǎn)品中心 Products