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cDNA 5’末端的快速擴(kuò)增(5’-RACE)
發(fā)布時間: 2021-12-21 點(diǎn)擊次數(shù): 1311次原理
在分子克隆中沒有比分離缺乏相應(yīng)的 mRNA 5' 末端的序列特征結(jié)構(gòu)的 cDNA 克隆更易失敗的了。通常存在于 cDNA 基因文庫中的部分克隆,由于反轉(zhuǎn)錄酶未能沿全長 mRNA 模板延伸*,合成的 cDNA 第一條鏈往往 5' 末端不完整。
材料與儀器
反轉(zhuǎn)錄酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 末端轉(zhuǎn)移酶緩沖液 熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶
擴(kuò)增緩沖液 氯仿 dATP dNTP 貯存液 胎盤 RNase 抑制劑 TE 反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液
瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠 制備型離心機(jī) SorvallSS - 34 轉(zhuǎn)頭步驟
一、材料
1. 緩沖液與溶液
10X 擴(kuò)增緩沖液
氯仿
dATP ( 1 mmol/L,二鈉鹽)
4 種 dNTP 貯存液(20 mmol/L, pH 8.0)
胎盤 RNase 抑制劑(20 單位/μl)
TE ( pH 7.6)
2. 酶與緩沖液
5X 反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液
反轉(zhuǎn)錄酶(RNA 依賴的 DNA 聚合酶)
末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(末端轉(zhuǎn)移酶)
5X末端轉(zhuǎn)移酶緩沖液
熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠
4. 核苷酸與寡核苷酸
接頭引物(10 μmol/L,5'GACTCGAGTCGACATCG3')溶于水中(10 pmol/μl)
(接頭引物可以與基因特異性正向引物聯(lián)合在一起用于擴(kuò)增特異性靶 cDNA。第一步 PCR 擴(kuò)增后,PCR 目的產(chǎn)物可能僅占總 DNA 產(chǎn)物的 1%,也可能多至占總 DNA 產(chǎn)物的 100%。如果必要,可用第一輪 PCR 產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二輪嵌套式 PCR,改善目的產(chǎn)物的產(chǎn)率,該輪 PCR 的引物為接頭引物與另一個基因特異性正向引物。在第二輪嵌套式 PCR 擴(kuò)增后,幾乎所有的擴(kuò)增產(chǎn)物在 EB 染色下呈現(xiàn)了靶 mRNA 的 5' 區(qū)域序列相一致的條帶。
RT-PCR 的引物用自動 DNA 合成儀合成,用于標(biāo)準(zhǔn) RT-PCR 的引物一般不需要進(jìn)一步純化。然而,如果寡核苷酸引物經(jīng)商品化的樹脂進(jìn)行柱層析純化(如 NENLife- Science 公司產(chǎn)品 NENSORB) 或者經(jīng)變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化,純化后的引物用于擴(kuò)增低豐度的 mRNA 時常常會更有效。)
(dT)17-接頭引物(10 μmol/L,5'GACTCGAGTCGACATCGA(T)173')溶于水中(10 pmol/μl)
基因特異性反義寡核苷酸引物(10 μmol/L) 溶于水(10 pmol/μl)。
(基因特異性反義寡核苷酸引物應(yīng)該與靶 mRNA 的已知序列互補(bǔ),其長度在 20~ 30 bp,內(nèi)含的 4 種堿基數(shù)量基本相等,G 與 C 堿基的平衡分布以及引物具有較低的自發(fā)形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的傾向?;蛱禺愋砸?1 用于步驟 2, 用反轉(zhuǎn)錄酶引導(dǎo)基因特異性第一鏈 cDNA 的合成?;蛱禺愋砸?2 是與靶 mRNA 的 5'序列互補(bǔ)的,用于 5'-RACE 反應(yīng)的擴(kuò)增階段?;蛱禺愋砸?2 也總是被插入適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn),這樣便于擴(kuò)增 cDNA 的進(jìn)一步克隆。)
隨機(jī)六核苷酸溶于 TE ( 1 mg/ml,pH 8.0)
總 RNA(100 μg/ml)或 poly (A)+ RNA(10 μg/ml)溶于水中
(總 RNA一般用離液劑(chaotropic agents) 從細(xì)胞中抽提的,選擇總 RNA 作模板一般適用于從中等程度到高豐度 mRNA 中通過 RT-PCR 克隆靶基因。對于低豐度靶 mRNA 的樣品最好選擇 poly (A) + RNA 作模板進(jìn)行 RT-PCR。運(yùn)用作為 RT-PCR 模板的 RNA 也可以從如下的少量培養(yǎng)細(xì)胞中制備。)
5. 離心機(jī)與轉(zhuǎn)頭
制備型離心機(jī)
SorvallSS - 34 轉(zhuǎn)頭
6. 特殊設(shè)備
自動微量移液器的屏蔽型槍頭
濃縮器(Centricon-100,Amicon 產(chǎn)品)
微量離心管(0.5 ml,薄壁擴(kuò)增反應(yīng)專用離心管)或微量滴定板
正向排液式移液器
PCR 儀
旋轉(zhuǎn)真空冷凍干燥機(jī)(可選擇)
水浴箱預(yù)設(shè)在 75℃ 和 80℃
二、方法
反轉(zhuǎn)錄
在實(shí)驗(yàn)開始時,首先要確定 5'-RACE 是否成功。如果反轉(zhuǎn)錄步驟是有效的,那么分離到含有靶 mRNA 的 5' 末端序列的克隆的幾率是較高的。另一方面,如果反轉(zhuǎn)錄步驟是無效的,那么本方案的后續(xù)步驟是無法補(bǔ)償?shù)摹R虼?,對于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件是值得花時間優(yōu)化的,如最佳的引物與模板比例,改變反應(yīng)體系 Mg2+ 濃度,尋找最適的 Mg2+ 濃度。
1. 轉(zhuǎn)移 1 pg 至 100 ng 的 poly (A) + RNA 或 1 μg 總 RNA 到一只新的離心管。用水調(diào)整體積至將 RNA 樣品在 75℃ 變性 5 min, 將離心管插入冰中冷卻。
2. 向這種含有已變性的 RNA 樣品的離心管內(nèi)依次加入如下試劑:
5X 反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 4 μl
20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液(pH 8.0) 1 μl
10 μmol/L 基因特異性反義引物 1 4 μl
約 20 單位/μl 胎盤 RNase 抑制劑 1 μl
水補(bǔ)足至 20 μl
反應(yīng)管溫育在反應(yīng) 60 min。設(shè)置 3 支陰性對照管。在一支對照管中加入合成第一鏈 cDNA 反應(yīng)所需的所有試劑,但不加模板 RNA;第二支對照管加入除了反轉(zhuǎn)錄酶外的所有試劑;第三支對照管中加入除引物外的所有試劑。這些對照管進(jìn)行所有的后續(xù)步驟。設(shè)置這些對照管能保證 cDNA 產(chǎn)物不是由于基因組 DNA 與寡核苷酸片段的污染或者由 RNA 模板分子的自身引導(dǎo)所致。
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的純化
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后,多余的 dNTP 和引物必須從反應(yīng)液中去除。此外,dNTP 在反應(yīng)液中的存在,一方面可能由末端轉(zhuǎn)移酶在 cDNA 的 3' 末端加尾,另一方面還可能危及第一鏈 cDNA 尾部序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)的能力。多余的引物的存在也會造成不利的影響,因?yàn)橐锏?3' 末端會與 cDNA 的加尾反應(yīng)相競爭。
3. 去除過剩的寡核苷酸或隨機(jī)六核苷酸引物可用水將反應(yīng)液終體積稀釋至 2 ml, 然后用 Centicon-100 微量濃縮器(Frohman 1993; for a description of this procedure, please see protocol 3 )。離心轉(zhuǎn)速為 500~1100 g ( 2000~3000 r/min, 用 Sorvall SS34 轉(zhuǎn)頭), 溫度在 4℃ 和 25℃ 之間離心 20 min。重復(fù)用水稀釋步驟和離心步驟。轉(zhuǎn)移潴留的液體到一支新的 0.5 ml 離心管,用旋轉(zhuǎn)真空抽干機(jī)使體積濃縮至 10 μl。
4. 加入 10 體積的如下試劑至反轉(zhuǎn)錄 cDNA 樣品中:
5X 末端轉(zhuǎn)移酶緩沖液 4 μl
1 mmol/L dATP 4 μl
末端轉(zhuǎn)移酶 10~25 單位
反應(yīng)管孵育在 37℃ 水浴中反應(yīng) 15 min。
5. 在 80℃ 放置 3 min 使末端轉(zhuǎn)移酶滅活。使帶有 dA 尾的 cDNA 樣品用 TE pH 7.6 稀釋至終體積 1 ml。
擴(kuò)增
6. 按以下次序,將各成分加入在一只 0.5 ml 滅菌離心管、擴(kuò)增管或滅菌微量滴定板的孔內(nèi),建立 PCR 系列反應(yīng)管:
已稀釋 cDNA 0~20 μl
10X 擴(kuò)增緩沖液 5 μl
20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液 5 μl
10 μmol/L (dT)17-接頭引物(16 pmol) 1.6 μl
10 μmol/L 接頭引物(32 pmol) 3.2 μl
10 μmol/L 基因特異性引物 2 ( 32 pmol ) 3.2 μl
1~2 單位熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶 1 μl
H2O 補(bǔ)足至 50 μl
如果實(shí)驗(yàn)必要,可建立系列的擴(kuò)增試驗(yàn)管用于篩選 cDNA 加尾模板產(chǎn)生最大量的擴(kuò)增 5' 末端。
7. 如果 PCR 儀沒有配置加熱蓋,在反應(yīng)混合液的上層應(yīng)加一滴礦物油(約 50 μl),防止樣品在 PCR 反應(yīng)多個加熱與冷卻的循環(huán)過程中蒸發(fā)。如果應(yīng)用熱啟動 PCR 程序,在反應(yīng)混合液上層加一滴石蠟油。放置離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。
8. 按以下方法進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。典型的程序有變性、復(fù)性和聚合(延伸反應(yīng));相應(yīng)的循環(huán)條件與溫度列表如下:
9. 抽取每種擴(kuò)增樣品 5~10 μl,用瓊脂凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴(kuò)增結(jié)果,用 DNA marker 來判斷擴(kuò)增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠)或 SYBR 金顆粒染色后來觀察擴(kuò)增的量與片段大小。
10. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內(nèi)樣品液體的上層(步驟 7),反應(yīng)結(jié)束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。
11. 從擴(kuò)增的 DNA 產(chǎn)物中分離掉殘余的熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶和 dNTP。以上就是本期的內(nèi)容,更多資訊,歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
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