我的siRNA怎么了？

這一期，我們來說一下siRNA轉(zhuǎn)染和干擾效果不佳的問題。

要保證RNA干擾的效果就必須保證siRNA能夠成功的轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中去，那有時(shí)候會(huì)轉(zhuǎn)染不進(jìn)去，原因可能有如下幾點(diǎn)：

1、轉(zhuǎn)染方法：轉(zhuǎn)染siRNA濃度太低。FAM驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率時(shí)siRNA(FAM)的量的終濃度是50-150nM都可以，需要根據(jù)細(xì)胞進(jìn)行摸索。lipo-2000的量和使用的siRNA量成比例的，一般用1:1的效果好一些。

建議用24孔板摸索條件。siRNA 所加的量及其濃度可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)自己調(diào)整，按照要求配成20uM的濃度，那1ul就是20pmol,在1ml細(xì)胞培養(yǎng)液中加1ul,那終濃度就是20nM,加2ul就是40nM，以此類推。24孔板摸濃度后，用6孔板時(shí)把轉(zhuǎn)染體系相應(yīng)放大即可。

實(shí)驗(yàn)中需要注意細(xì)胞狀態(tài)要好，代數(shù)不要大，細(xì)胞密度適中，50%左右（根據(jù)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況調(diào)節(jié)），鋪板時(shí)要鋪均勻，添加轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)要小心滴加。轉(zhuǎn)染時(shí)建議不要使用雙抗和血清，雙抗轉(zhuǎn)染時(shí)對(duì)細(xì)胞有毒性，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不好，血清會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。

2、轉(zhuǎn)染試劑：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過這些資料可選擇較為適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑?？赡芗?xì)胞對(duì)LIP2000不是太敏感，如果是這樣，建議更換其他的轉(zhuǎn)染試劑

3、細(xì)胞原因：

a、和細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞代數(shù)、細(xì)胞密度等有關(guān)，一般低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔?。較為適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。也就是說同一種系的細(xì)胞株，在各實(shí)驗(yàn)室不同培養(yǎng)條件下，其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果

b、有的細(xì)胞不太好轉(zhuǎn)染，比如懸浮、干細(xì)胞、原代等，可查找相關(guān)文獻(xiàn)，看別人做這種細(xì)胞時(shí)用的什么方式。如果細(xì)胞不好轉(zhuǎn)，就要考慮換一種方式進(jìn)行您的實(shí)驗(yàn)了，比如說用病毒、電轉(zhuǎn)等。

轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞后拍的圖片，轉(zhuǎn)染進(jìn)去的整個(gè)細(xì)胞是綠色的，可以清晰的看到細(xì)胞形態(tài)，沒有轉(zhuǎn)染進(jìn)去的就是綠色的小點(diǎn)兒。

如果通過上邊的問題驗(yàn)證到siRNA的確是可以轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，但干擾效果又不理想的話那么可能的原因來了：

1、轉(zhuǎn)染效率問題，如果少量siRNA進(jìn)入細(xì)胞，作用于基因后，有時(shí)候細(xì)胞會(huì)有補(bǔ)償機(jī)制，表達(dá)量反而升高。建議在實(shí)驗(yàn)前，先檢測(cè)一下轉(zhuǎn)染效率，觀察一下，轉(zhuǎn)染進(jìn)去的整個(gè)細(xì)胞是綠的，沒有轉(zhuǎn)染進(jìn)去的是一些綠色的小點(diǎn)粘附在細(xì)胞上，發(fā)的光是點(diǎn)狀的。轉(zhuǎn)染進(jìn)去的整個(gè)細(xì)胞是綠色的，可以清晰的看到細(xì)胞形態(tài)，沒有轉(zhuǎn)染進(jìn)去的就是綠色的小點(diǎn)兒，建議多做幾個(gè)轉(zhuǎn)染梯度，找到最佳轉(zhuǎn)染條件。

2、檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，建議轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)檢測(cè)基因水平變化，48-72小時(shí)檢測(cè)蛋白水平變化。不同基因的半衰期是不同的，siRNA干擾是拋物線形的，多做幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)有利于siRNA干擾效果的測(cè)定

3、推薦RT-PCR的引物應(yīng)該設(shè)計(jì)在target位置的兩側(cè)，而不是同側(cè)。目前已經(jīng)知道的siRNA介導(dǎo)的基因knockdown機(jī)制是RSIC先介導(dǎo)靶mRNA的切割，切割導(dǎo)致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的時(shí)間點(diǎn)，因此，設(shè)計(jì)于同側(cè)的PCR引物可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果或knockdown效率的低估。

4、RNA降解，建議-20保存，溶解后要最小量分裝，-20最好-80保存，3個(gè)月內(nèi)用完，避免反復(fù)凍融或者4度保存。干粉保存最長(zhǎng)不要超過6個(gè)月

4、基因問題。有的基因受細(xì)胞調(diào)控比較嚴(yán)格，mRNA能敲除，但是蛋白水平敲除不下來的，如果這樣，建議換一種細(xì)胞看看

5、干擾靶點(diǎn)不合適。需重新設(shè)計(jì)siRNA。