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高效率轉(zhuǎn)染人淋巴瘤細(xì)胞的操作方法
發(fā)布時(shí)間: 2021-11-11 點(diǎn)擊次數(shù): 998次轉(zhuǎn)染條件:
培養(yǎng)板:6孔板
轉(zhuǎn)染試劑用量:10ul
核酸用量:電訊
轉(zhuǎn)染試劑:AD600150,Zeta Life Advanced DNA RNA轉(zhuǎn)染試劑
轉(zhuǎn)染時(shí)間:48小時(shí)
高效率轉(zhuǎn)染效果圖如下:
操作步驟
提前 1 天接種細(xì)胞:細(xì)胞匯合度在 60-80%左右,再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
核酸復(fù)合物制備:將核酸與轉(zhuǎn)染試劑按照 1:1 關(guān)系直接混合,用移液器吹吸 10-15 次混勻,室溫靜 止 10-15 分鐘。
在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入核酸復(fù)合物:根據(jù)參考用量在細(xì)胞中加入核酸復(fù)合物,并輕輕混勻;細(xì)胞培養(yǎng)基 里面可以含有血清。
細(xì)胞換液:轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后對細(xì)胞進(jìn)行正常換液,懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中不用換液。
分析結(jié)果:質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染 48-72 小時(shí)后熒光檢測轉(zhuǎn)染效率,48-96 小時(shí)檢測 mRNA 或蛋白表達(dá)。若進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選,則在轉(zhuǎn)染后 24-48 小時(shí)左右加入適量的藥物進(jìn)行篩選。siRNA 轉(zhuǎn)染后 9 小時(shí)熒光檢測轉(zhuǎn)染效率,48-72 小時(shí)檢測 mRNA 或蛋白表達(dá)。
注意事項(xiàng):
1、質(zhì)粒 DNA 必須溶解于無菌雙蒸水或超純水,但不能溶解于提取試劑盒提供的 Buffer。溶解于 Buffer 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率會(huì)下降 80%左右,甚至?xí)D(zhuǎn)染失敗。
2、質(zhì)粒必須去除內(nèi)毒素,內(nèi)毒素對細(xì)胞將產(chǎn)生很大的細(xì)胞毒性,會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率下降 70%-80%左 右,甚至導(dǎo)致轉(zhuǎn)染失?。ㄍ扑]使用 Qiagen、TIANGEN、Omega 去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒)。
3、復(fù)合物的制備過程中是絕對不能用其他任何試劑對核酸或轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行稀釋,只需將核酸和轉(zhuǎn)染 試劑兩者按 1:1 比例直接混合,如果進(jìn)行了稀釋會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染失。
4、轉(zhuǎn)染試劑與核酸混勻后用移液器吹打 10-15 次,室溫孵育 10-15 分鐘后即可加入細(xì)胞培養(yǎng)板。
5、轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后進(jìn)行正常換液,不能像 Lipo2000 一樣轉(zhuǎn)染 4-6 小時(shí)后換液。
6、原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí),細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基里面不能含有雙抗培養(yǎng)基。
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