難轉(zhuǎn)染細(xì)胞Thp-1高效率轉(zhuǎn)染條件分享

Thp-1細(xì)胞高效率轉(zhuǎn)染條件分享

一、轉(zhuǎn)染材料準(zhǔn)備

1. 轉(zhuǎn)染試劑用量：10ul

2. siRNA濃度：20um/L

3. 細(xì)胞密度：1*106-1*105

4. 轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)板：6孔板

5. 轉(zhuǎn)染試劑：Advanced DNA RNA轉(zhuǎn)染試劑；貨號(hào)：AD600150

6. 轉(zhuǎn)染時(shí)間：48小時(shí)

7. 細(xì)胞培養(yǎng)胎牛血清：Z7180FBS-500超低內(nèi)毒素胎牛血清

8. 細(xì)胞凍存液：L0100無血清細(xì)胞凍存液.

注意：本細(xì)胞轉(zhuǎn)染用量條件不適合lipo使用。

二、操作過程：

1.提前1天接種細(xì)胞：細(xì)胞匯合度在60-80%左右，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2. 核酸復(fù)合物制備：將核酸與轉(zhuǎn)染試劑按照比例關(guān)系直接混合，用移液器吹打、混勻，室溫靜止15分鐘。

3.在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入核酸復(fù)合物：根據(jù)參考用量在細(xì)胞中加入核酸復(fù)合物，并輕輕混勻；細(xì)胞培養(yǎng)基里面可以含有血清。

4.細(xì)胞換液：轉(zhuǎn)染24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行正常換液，懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中不用換液。

5.分析結(jié)果：質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后熒光檢測轉(zhuǎn)染效率，48-96小時(shí)檢測mRNA或蛋白表達(dá)。若進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選，則在轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)左右加入適量的藥物進(jìn)行篩選。siRNA轉(zhuǎn)染后9小時(shí)熒光檢測轉(zhuǎn)染效率，48-72小時(shí)檢測mRNA或蛋白表達(dá)。