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初代細胞培養(yǎng)——消化培養(yǎng)法
發(fā)布時間: 2021-11-08 點擊次數: 1307次材料與儀器組織
Hanks 培養(yǎng)液 胰蛋白酶
吸管 平皿 培養(yǎng)瓶 燒杯 攪拌器 三角燒瓶 不銹鋼篩 眼科剪 眼科鑷 計數板實驗步驟1. 準備
取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面,紫外線消毒20 分鐘;
2. 布局
點燃酒精燈(或煤氣燈),安裝吸管帽(應通過火焰);
3. 處理組織
把組織塊置入燒杯中,用Hanks液漂洗2~3 次,去除血污;如懷疑組織可能污染,可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘;
4. 剪切
用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊(用手術刀割亦可),以便于消化;加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角燒瓶中,結扎瓶口或塞以膠塞;
5. 消化
或用恒溫水浴,或置入37 ℃溫箱消化均可,消化中每隔20 分鐘應搖動一次,如用電磁恒溫攪拌器消化更好(消化前瓶中需置一無菌攪棒);消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定;
6. 分離
在消化過程中見消化液發(fā)混濁時,可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察,如組織已分散成細胞團或單個細胞,立即終止消化,隨即通過適宜不銹鋼篩,濾掉尚未充分消化開的組織塊(必要時可繼續(xù)進行消化);低速(500~1000 轉/分)離心消化液5 分鐘,吸出上清,加入適量含有血清的培養(yǎng)液(如有其它酶或EDTA 等消化,需用Hanks液洗脫一兩次后,再加入培養(yǎng)液);
7. 計數
用計數板計數,如細胞懸液細胞密度過大,再補加培養(yǎng)液調整后,分裝入培養(yǎng)瓶中;對大多數細胞來說,pH 要求在7.2~7.4范圍,培養(yǎng)液呈微紅色,如顏色偏黃,說膽液體變酸,可用NaHCO3調整;
8. 培養(yǎng)
置入36.5 ℃溫箱培養(yǎng);如用CO2溫箱培養(yǎng),瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞,紗布塞易生霉菌,每次換液時需更換新塞。- 下一篇:細胞STR鑒定相關問題匯總
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