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    氨甲喋呤抗性和DHFR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方法

    發(fā)布時(shí)間: 2021-10-29  點(diǎn)擊次數(shù): 943次
    材料與儀器

    中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞或生長(zhǎng)快的人或小鼠細(xì)胞系 氨甲蝶呤鈉鹽
    0.15mol LNaCl
    組織培養(yǎng)瓶 吸管 不含胸苷和次黃(口票)呤的培養(yǎng)瓶 倒置顯微鏡 液氮罐

    實(shí)驗(yàn)步驟

    1. 克隆培養(yǎng)親代細(xì)胞形成生長(zhǎng)旺盛、基因型一致的細(xì)胞群體,用于篩選。

    2. 用無菌 NaCl 0.15 mol/L ( 0.85 % ) 稀釋 MTX,臨床使用的包裝是濃度為 2.5 mg/ml 的溶液。

    3. 在幾個(gè)相同的培養(yǎng)瓶中分別種 2.5×105 個(gè)細(xì)胞,每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入不含 MTX 或含 0.01 μg/ml、0.02 μg/ml、0.05 μg/ml 和 0.1 μg/ml MTX 的*培養(yǎng)基,將培養(yǎng)基的 pH 調(diào)至 7.4,37°C 培養(yǎng) 5~7 天。

    4. 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞,如果培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)有一小部分細(xì)胞克隆生長(zhǎng),其余的一些細(xì)胞是變大的,附著在基質(zhì)層上的可能要死的細(xì)胞,選擇這種培養(yǎng)瓶的細(xì)胞,換含有相同量 MTX 的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

    5. 如果需要,可以更換新鮮培養(yǎng)基,再培養(yǎng) 5~7 天,但是細(xì)胞必須始終處于 MTX 環(huán)境中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 2~10×106 個(gè)/瓶,將細(xì)胞以每瓶 2.5×105 個(gè)傳入新培養(yǎng)瓶,分別加人原濃度的 MTX 和 2~10 倍原濃度的 MTX 。

    6. 5~7 天后觀察新傳代的和原來加入較高濃度 MTX 的細(xì)胞,更換培養(yǎng)基,選擇可用細(xì)胞,方法同前。

    7. 每步傳代的細(xì)胞用逐步增高的藥物濃度持續(xù)篩選,直至獲得要求的耐藥水平。改變而獲得低到中等水平耐藥、DHFR 活性增加和(或)轉(zhuǎn)運(yùn)能力改變的中同倉(cāng)鼠細(xì)胞需要 2~3 個(gè)月;對(duì)于中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞或生長(zhǎng)快的人的細(xì)胞來說,獲得高水平耐藥性和酶過度產(chǎn)生的變異株需要 4~6 個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。

    8. 定期凍存篩選中的細(xì)胞于液氮中。


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