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分子克隆實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)和經(jīng)驗(yàn)分享
發(fā)布時(shí)間: 2024-01-16 點(diǎn)擊次數(shù): 528次簡介:
分子克?。ɑ蚩寺?DNA重組/載體構(gòu)建)技術(shù)是一種在分子水平上操作的技術(shù),用于將特定的DNA片段從供體生物中分離出來,然后通過體外重組、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方法,將其插入到適合的克隆載體中,并將重組克隆載體引入到合適的寄主體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增??梢詰?yīng)用于蛋白表達(dá)、病毒包裝、基因治療、細(xì)胞治療、mRNA疫苗、RNA干擾、細(xì)胞功能等研究。
具體操作流程:
一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,借助一小段雙鏈DNA來啟動合成,通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合,形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下,DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3'-OH末端,并以此為起始點(diǎn), 沿模板5'→3'方向延伸,合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。
(1)PCR反應(yīng)基本成分:
①模板DNA
基因組DNA上的某個基因或DNA片段;也可以是mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA鏈。 ②引物 先由引發(fā)酶(一種特殊的RNA聚合酶)在DNA模板上合成一段RNA鏈,它提供引發(fā)末端被稱為引物,接著由DNA聚合酶從RNA引物3^端開始合成新鏈。 ③dNTPs (dATP、dCTP、dGTP和dTTP) 是PCR反應(yīng)中靶DNA序列擴(kuò)增的原料。在PCR反應(yīng)中每種脫氧核苷三磷酸的濃度以50-200μmol/L為宜, 不能低于10-15μmol/L。 ④DNA聚合酶 該片段具有聚合酶活性和3'→5'外切核酸酶活性, 能識別和消除錯配的引物末端, 以校正復(fù)制過程中錯配的核苷酸。 通過雙鏈DNA的高溫變性 (denaturation),目的是要使雙鏈DNA解鏈成單鏈。引物與模板的低溫退火 (annealing) ,作用是使模板DNA單鏈或上一輪的反應(yīng)產(chǎn)物與引物相結(jié)合。適溫延伸 (extension),引物延伸是DNA聚合酶將脫氧單核苷酸逐一地加到引物3'-OH末端, 依據(jù)模板序列合成一條互補(bǔ)新鏈的過程。這三步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)。每一循環(huán)中所合成的新鏈, 又都可作為下一循環(huán)中的模板。 (2)反應(yīng)體系(50ul體系) (3)反應(yīng)程序: 二、線性化載體
在目標(biāo)載體質(zhì)粒上選取合適的位點(diǎn)進(jìn)行單酶切或雙酶切,對酶切后的載體進(jìn)行割膠純化。 環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型: ①當(dāng)其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)時(shí),稱之為共價(jià)閉合環(huán)形DNA(cccDNA),這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型; ②如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu),另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口時(shí),稱之為開環(huán)DNA(ocDNA),此即OC構(gòu)型; ③若質(zhì)粒DNA經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶切割之后,發(fā)生雙鏈斷裂形成線性分子(IDNA),通稱L構(gòu)型。 線性化之后的質(zhì)粒比正常質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳中跑的慢。 三、純化PCR、酶切產(chǎn)物并連接
將反應(yīng)結(jié)束的產(chǎn)物進(jìn)行純化,純化所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好,目前有多種試劑盒可供選擇;
連接線性化載體和PCR產(chǎn)物,可根據(jù)DNA連接酶試劑盒說明書設(shè)置,對于較大的片段可以選擇4℃連接過夜。
四、細(xì)菌轉(zhuǎn)化
冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞(DH5α);取重組產(chǎn)物,加至感受態(tài)細(xì)胞中,冰上靜置30min,42℃水浴熱激45s,迅速置于冰上2-3min;加入600μL LB液體培養(yǎng)基,37℃搖菌1h。
五、菌落PCR 用滅過菌的 10ul 小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中,振蕩混勻。然后用正常的 PCR 反應(yīng)程序可。 PCR正常反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,選擇正確條帶的菌液加入對應(yīng)的培養(yǎng)基,37℃搖起來。
注意事項(xiàng):
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ①所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。 ②PCR 試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水。 ③試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。 ④PCR 的樣品應(yīng)在冰浴上化開,并且要充分混勻。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 ①冰上解凍感受態(tài)細(xì)胞:大腸桿菌經(jīng)過低溫(0度)預(yù)處理的低滲cacl2溶液,造成細(xì)胞膨脹,細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變,即易與外源DNA相黏附并在細(xì)胞表面形成復(fù)合物。 ②熱激轉(zhuǎn)化利用氯化鈣來產(chǎn)生富含鈣離子的環(huán)境,從而抵消質(zhì)粒DNA和細(xì)菌細(xì)胞膜之間的靜電排斥。溫度的急劇提高可以在細(xì)菌胞膜表面形成小孔,質(zhì)粒DNA就可進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。 菌落PCR ①在做菌落 PCR 的時(shí)候,每次都要做陰性、陽性對照,陽性對照可以用抽提好的質(zhì)?;蚧蚪M,這樣可以確定 PCR 主反應(yīng)液的配制沒有問題。 ②菌落PCR反應(yīng)程序變性94℃4-5min即可保證外源DNA釋放出來。
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