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    3D 細(xì)胞培養(yǎng)具體操作

    發(fā)布時間: 2023-01-10  點擊次數(shù): 965次

    體外三維細(xì)胞建模和成像是候選分子毒性評估的一個有價值的早期步驟,3D細(xì)胞培養(yǎng)很大程度上可檢測臨床前藥物開發(fā)工作流程,包括在細(xì)胞、組織、器官和整個有機體的迭代更高生物水平上的毒性評估。在這些層次上建模和成像的能力是分子評估和發(fā)展的強大工具。


    3D細(xì)胞培養(yǎng)中的單個細(xì)胞提供了關(guān)于分子亞細(xì)胞對一般細(xì)胞功能的影響的數(shù)據(jù),如細(xì)胞生長速度。3D細(xì)胞培養(yǎng)也用于評估特定細(xì)胞類型的毒性,提供組織和器官功能的數(shù)據(jù)。


    3D細(xì)胞培養(yǎng)允許細(xì)胞生長,培養(yǎng)物向各個方向擴展,從而模擬自然的微結(jié)構(gòu)。這種類型的培養(yǎng)提供了對分子對細(xì)胞間相互作用的影響,其方式比二維單層培養(yǎng)更具生理學(xué)意義。3D培養(yǎng)的高分辨率成像提供了分子對組織結(jié)構(gòu)和完整性的影響的有價值的信息。


    在藥物開發(fā)過程的早期,擁有相關(guān)的、可靠的和可預(yù)測的細(xì)胞毒性數(shù)據(jù),可以避免可能導(dǎo)致臨床試驗失敗的毒性試驗,從而有助于降低用藥風(fēng)險和科研成本。

     

    實驗前準(zhǔn)備工作


    1.準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)試劑

    2.將分裝好的Matrigel基質(zhì)膠提前24 h從-20℃放入4℃,使其融化成液體狀態(tài);將無菌的1 mL移液器槍頭放入無菌50 mL離心管內(nèi),置-20℃冰箱預(yù)冷。

    瓊脂糖包被96孔板

    3.準(zhǔn)確量取6 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基于2個10 mL的注射玻璃瓶內(nèi),加入90 mg瓊脂糖,蓋塞后放入80℃的水浴鍋內(nèi)加熱溶解30 min;

    4.加熱結(jié)束后,將注射瓶放入滅菌鍋內(nèi),115℃滅菌30 min;

    滅菌完成后,迅速取出注射瓶放入超凈臺內(nèi)。將注射瓶內(nèi)的瓊脂糖溶液倒入無菌的加樣槽中,用多通道移液器以每孔60 μL的量加入96孔板內(nèi)。

    注意:由于瓊脂糖溶液在室溫時會凝固,因此從滅菌鍋內(nèi)取出瓊脂糖溶液后一定要快速轉(zhuǎn)移至超凈臺內(nèi)并迅速加入至96孔板中。

    此外,為保證加樣時瓊脂糖不冷卻,需要同時滅菌加樣槽和100 μL的移液器槍頭。

    5. 加入完成后,96孔板要保持水平約30 min使孔內(nèi)的瓊脂糖凝固。

    配置含Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞懸液

    取對數(shù)生長期的細(xì)胞以cell systems原代視網(wǎng)膜內(nèi)皮為例,胰蛋白酶消化后進行細(xì)胞計數(shù),用CultureBoost 經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至2.0×105 cells/mL,備用。

    將盛滿碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺內(nèi),將CultureBoost 經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基及解凍的Matrigel基質(zhì)膠從冰箱內(nèi)取出置于冰上.

    注意:由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固,因此在操作過程中一定要保持低溫。

    3. 將預(yù)冷的移液器槍頭取出放置于超凈臺內(nèi)。根據(jù)計算量(2.5%,v/v)用移液器將300 μL Matrigel基質(zhì)膠加入到12 mL 完-全培養(yǎng)基內(nèi),迅速混勻。

    注意:由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固,因此使用的移液器槍頭也需要預(yù)冷。

    加入步驟1中的細(xì)胞懸液(約600 μL),使細(xì)胞濃度為10000 cells/mL,迅速混勻,備用;

    將細(xì)胞懸液鋪入瓊脂糖包被的96孔板

    1. 將上述步驟4中配置好的含有Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞懸液放入加樣槽內(nèi),用多通道移液器吸取200 μL加入到包被瓊脂糖的96孔板內(nèi)。

    2. 采用低溫離心機進行離心,離心條件為4℃,1000×g,10 min,將96孔板周圍用封口膜封住。

    3.人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞長的比較慢在培養(yǎng)的第3.7和10天,并2天更換一次孔內(nèi)的100ul培養(yǎng)基。

    若要做給藥實驗,計算好OD值和IC50,配成100ul的培養(yǎng)基,培養(yǎng)成球后,吸出常規(guī)培養(yǎng)基換成加藥培養(yǎng)基即可。


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