非肌肉肌動(dòng)蛋白的純化

步驟

1. 準(zhǔn)備貯存液和材料。

2x DNA 酶Ⅰ緩沖液：

20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0

1 mmol/L DTT

0.4 mmol/L CaCI2

0.4 mmol/L ATP

抑蛋白酶肽

抑蛋白酶

亮抑蛋白酶肽

抑胃酶肽 A

PMSF

TPCK

50% 甲醛在 DNA 酶柱緩沖液中

0.4 mol/L NH4CI 在 DNA 酶Ⅰ緩沖液中

0.3 mol/L KCl 在 DNA 酶Ⅰ緩沖液中

DNA酶Ⅰ柱緩沖液

2. 準(zhǔn)備一個(gè) 5~10 ml 的 DNA 酶Ⅰ的親和柱。

3. 準(zhǔn)備一個(gè) 0.2 ~1 ml 的 DEAE 柱：用 DNA 酶Ⅰ緩沖液平衡的 DEAE-纖維素。

4. 通過(guò)離心收集細(xì)胞并用等滲鹽溶液（例如 PBS ) 洗去培養(yǎng)液。

5. 在加蛋白酶抑制劑的 DNA 酶柱緩沖液中重懸細(xì)胞沉淀物。

6. 用對(duì)于感興趣細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行細(xì)胞勻漿。

7. 用相差顯微鏡證實(shí)超過(guò) 99% 的細(xì)胞已經(jīng)裂解了。

8. 100000 g 離心裂解物 45 分鐘。

9. 用巴斯德吸管轉(zhuǎn)移上清，避免混入脂肪。

10. 柱子上樣：

(1) 上清和用 DNA 酶Ⅰ緩沖液加蛋白酶抑制劑平衡了的 DNA 酶Ⅰ親和介質(zhì)混合，并把介質(zhì)/蛋白混合物倒到一個(gè)小桿子中。

(2) 在裝填柱子時(shí)收集流出液，通過(guò)用抗肌動(dòng)蛋白抗體進(jìn)行的免疫印跡、DNA 酶Ⅰ抑制分析或 SDS-PAGE 來(lái)證實(shí)有大量肌動(dòng)蛋白留在柱子中。

11. 用 2 倍體積含蛋白酶抑制劑的 DNA 酶柱緩沖液洗柱子，然后用含蛋白酶抑制劑和 0.4 mol/L NH4Cl 的 DNA 酶柱緩沖液洗柱子。

12. 用含 50% 甲醛的 DNA 酶Ⅰ柱緩沖液洗脫肌動(dòng)蛋白。

13. 立即把 50% 甲醛洗脫液上樣到 0.2~1 ml DEAE 柱子上。

14. 用 5 倍體積的 DNA 酶Ⅰ柱緩沖液洗 DEAE 柱，然后用含 0.3 mol/L KCl 的 DNA 酶Ⅰ柱緩沖液洗脫。分部收集，每管 200 μl。

15. 檢測(cè)收集液的蛋白濃度，然后混合出峰時(shí)的收集液。

16. 加 MgCl2 使?jié)舛葹?2 mmol/L ( 這是選用于天然肌動(dòng)蛋白），以使肌動(dòng)蛋白聚合，用 SDS-PAGE 分析多肽組成。

產(chǎn)量應(yīng)該是 5% 左右，所以從濕重 10 g 的細(xì)胞指望得到 2.5~5 mg 純化了的肌動(dòng)蛋白是合理的。