補(bǔ)骨脂素介導(dǎo)的光交聯(lián)反應(yīng)研究RNA與蛋白質(zhì)分子間的作用實(shí)驗(yàn)

步驟

一、材料與設(shè)備

1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置。

2. 光化學(xué)反應(yīng)裝置（360 nm 長波長）：建議采用 Rayons RPR-100 光化學(xué)反應(yīng)裝置 ( The Southern New England Ultraviolet Company，Branford，USA )。其他紫外光源 ( 如 Stratalinker ) 也都可以使用。此外，長波長的手提紫外燈（如 Model UVGL-25， San Gabriel，CA，USA ) 也適用于交聯(lián)反應(yīng)，但需要照射較長吋間。

3. Sep-pak C18 膠片，購自 Waters ( MiIford，MA，USA）公司。

4. 旋轉(zhuǎn)真空干燥儀。

5. Sigmacote ( 可購自 Sigma 公司，St. Louis，MO，USA；為 Sigma 公司的一種硅烷化試劑）。

6. 變性膠電泳緩沖液（TBE）：0.09% mol/L Tris-硼酸，0.002 mol/L EDTA。配制 5X TBE 儲存液：取 900 ml 雙蒸水溶解 54 g Tris 和 27.5 g 硼酸，加入 20 ml 的 0.5 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ) 定容 1L， 高壓滅菌后保存。

7. 非變性膠電泳緩沖液：含 0.1% Triton X-100 的 TBE 緩沖液。

8. 1X 結(jié)合緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)，20 mmol/L KCl，0.1% Triton X-100。

9. 10X 水解緩沖液：等體積混合 0.5 mol/L Na2CO3 和 0.5 mol/L NaHCO3 ( pH 9.2 )。

10. Nase T1，RNase T1 緩沖液：16 mmol/L 檸檬酸鈉（pH 5.0 )，0.8 mmol/L EDTA，0.5 mg/mL tRNA，3.5 mol/L 尿素。

11. Nase B cereos，Nase B cereos 緩沖液：16 mmol/L 檸檬酸鈉（pH 5.0 )， 0.8 mmol/L EDTA，0.5 mg/ml tRNA。

12. 電泳上樣緩沖液：9 mol/L 尿素，1 mmol/L EDTA，0.1% 溴酚藍(lán)或 98% 甲酰胺。1 mmol/L EDTA，0.1% 溴酚藍(lán)；非變性電泳上樣緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)，20 mmol/L KCl，0.1% Triton X-100，40% ( m/V ) 甘油，0.1% 溴酚藍(lán)。

13. 40% (m/V) 丙烯酰胺儲存液：380 g 丙烯酰胺，20 g 甲叉雙丙烯酰胺，定容至 1 L，過濾后 4°C 保存。變性膠工作液中含 7 mol/L 尿素和 1X TBE；非變性膠工作液中含 0.1% Triton X-100 和 1X TBE。

14. RNA 洗脫緩沖液：TBE 緩沖液 ( pH 7.2 ) ( 以 0.1 mol/L HCl 調(diào) pH )。

15. 四甲基乙二胺（TEMED) 和過硫酸銨。

16. 補(bǔ)骨脂素修飾的多肽或蛋白分子，5' 或 3' 末端標(biāo)記 32P 的 RNA。

17. AMV 反轉(zhuǎn)錄酶及反應(yīng)緩沖液（購自 Promega 公司）。

18. 放射自顯影所需的 X 射線片，壓片盒及圖像處理儀器等。

19. 蛋白酶 K 及反應(yīng)緩沖液：10 mmol/L Tris-HCI ( pH 7.8 )，5 mmol/L EDTA 和 0.5% SDS。

20. 8-羥基補(bǔ)骨脂素，1，3-二碘丙烷，碳酸鉀，丙酮，石油醚，乙酸乙酯，硫酸鈉，硅膠 ( 購自 Aldrich 公司 )。

21. 0.1 mol/L 磷酸鈉（pH 7.4 )。

22. 10% 三Fyi suan水溶液。

23. 二甲基甲酰胺。

二、操作方法

1. 同半胱氨酸反應(yīng)的補(bǔ)骨脂素合成

即合成 1 號化合物：8-[ ( 3碘丙基-1 )氧 ]補(bǔ)骨脂素 [ 8-[ ( 3-iodopropyl-1) oxy] psor-alen ]。

(1) 在 100 ml 的腳底燒瓶內(nèi)將 8-羥基補(bǔ)骨脂素（0.176 g，1 mmol )，1，3 -二碘丙烷 ( 1.15 ml，2.96 g，10 mmol ) 和碳酸鉀（1.38 g，10 mmol ) 溶解于 15 ml 丙酮中。

(2) 混合物于室溫振搖 10 h，薄保層析法對反應(yīng)進(jìn)行檢測（展開劑：石油醚：乙酸乙酯，4：1 )。反應(yīng)*時(shí)無起始物質(zhì)。

(3) 真空濃縮燥反應(yīng)物。

(4) 30 ml 水溶解干燥產(chǎn)物，以 20 ml 乙酸乙酯萃取 3 次。

(5) 用 30 ml 水洗萃取產(chǎn)物，再用 10 ml 飽和氯化鈉洗 1 次萃取產(chǎn)物。

(6) 加入約 2 g 硫酸鈉，室溫放置 4~6 h。

(7) 以硅膠對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行層析，石油醚：乙酸乙酯（4 : 1 ) 洗脫產(chǎn)物。純化得到的 1 號化合物（0.31 g ，產(chǎn)率為 85% ) 為淡黃色固體。

2. 補(bǔ)骨脂素與蛋白結(jié)合

(1) 通過定點(diǎn)突變或固相合成多肽將活性半胱氨酸插入到蛋白的特定位置。

(2) 對蛋白進(jìn)行純化和特性檢測之后將蛋白 (1 nmol ) 和前面制備的 1 號化合物 (10 nmol ) 一同溶解于 100 μl 二甲基甲酰胺。

(3) 加入 50 μl 0.1 mol/L，pH 7.4 的磷酸鈉緩沖液，調(diào) pH 至 7.0。

(4) 室溫放置 16 h。

(5) 在反應(yīng)液中加入約 10 μl 10% 三Fyi suan水溶液調(diào)節(jié)溶液的 pH 至 4.0~5.0 之間。

(6) 用 0.5 ml 氯仿提取未反應(yīng)的補(bǔ)骨脂素，重復(fù) 3 次。

(7) 用 0.2 ml 1% 三Fyi suan水溶液洗有機(jī)相 3 次，回收溶解的多肽。

(8) 合并水相，在旋轉(zhuǎn)真空濃縮儀中將總體積濃縮至約 200 μl。

(9) 通過 TIPLC ( 采用 Zorbax 300 SB-C8 column 或其他適用于所研究的蛋白的柱料）純化結(jié)合補(bǔ)骨脂素的蛋白。所得到的結(jié)合了補(bǔ)骨脂素的蛋白的產(chǎn)率通常為 80% 左右。

3. 光交聯(lián)

(1) 小量交聯(lián)反應(yīng)

在進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)前先制備變性聚丙烯酰胺凝膠（含 1X TBE 和 7 mol/L 尿素）。

將制備好的凝膠以 30W 功率預(yù)電泳 3~4 h。

將末端標(biāo)記了 32P 的 RNA 溶解于 20 μl 結(jié)合緩沖液中（終濃度約為 2.5 μmol/L )， 85℃ 加熱 3 min 使 RNA 變性，再讓其逐漸冷卻至室溫，使 RNA 再折疊。

取 2 μl RNA，2 μl 5X 結(jié)合緩沖液，1 μl 0.1 μg/μl 酵母 tRNA，1~5 μl 雙蒸水，再加入結(jié)合了補(bǔ)骨脂素的蛋白，終體積為 10 μl ( 加入的蛋白量可通過凝膠電泳分析，選取合適的 RNA/蛋白比率)。

將反應(yīng)液混勻，冰浴 20 min；同時(shí)用 95% 乙醇擦洗一個(gè)干凈的小玻璃平板，用 Sigmacote 硅化，從而更好的回收交聯(lián)后的樣品，將平板罝于冰上。

將準(zhǔn)備好的樣品轉(zhuǎn)移到平板上，紫外照射（360 nm）10 min 至 20 min ( 最佳照射時(shí)間需根據(jù)時(shí)間-效成曲線判定）。

將照射后的樣品轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的小管內(nèi)，以 10 μl 上樣緩沖液沖洗平板上殘留的樣品斑點(diǎn)后也合并入小管內(nèi)。

再向經(jīng)照射的樣品中加入 10 μl 上樣緩沖液，再在所有的樣品中加入 1 μl 20 μg/μl 酵母 tRNA 競爭 RNA 蛋白的結(jié)合。

所有的樣品于 90°C 加熱 3 min，上樣電泳，以 30W 功率電泳 2~4 h，直至溴酚藍(lán)前沿距膠底部 5 cm 位置。

拆膠后用保鮮膜包裹，于 -80℃ 放射自顯影。

(2) 大量交聯(lián)的制備

確定 RNA 分子上的交聯(lián)位點(diǎn)時(shí)需要大量的交聯(lián)反應(yīng)。前面提及的交聯(lián)反應(yīng)可以擴(kuò)大 100 倍甚至更大，而終體積卻可以縮小至原先的一半。在紫外照射交聯(lián)時(shí)，為保證交聯(lián)效率和便于操怍，點(diǎn)在平板上的樣品最好不要多于 20 μl。

電泳膠的制備同前所述，同樣需要預(yù)電泳。

在紫外照射后，用 1/10 體積 3 mol/L NaAc ( pH 5.2 ) 和 2.5 倍體積的無水乙醇于 -80℃ 放置 30 min 以沉淀 RNA 和 RNA 交聯(lián)物。

于 16000 g 離心 20 min 去上淸，用少量的 75% 乙醇洗沉淀，再次離心去上淸。真空抽干。

用上樣緩沖液重懸產(chǎn)物，加入酵母 tRNA，90℃ 加熱 3 min，上樣電泳，同時(shí)在旁邊上樣孔內(nèi)加入末端標(biāo)記的 RNA 作為對照。

拆膠后用保鮮膜包裹，于室溫放射自顯影（時(shí)間較短）。

對照放射自顯影的結(jié)果切下 RNA 和交聯(lián)物，搗碎，用 RNA 洗脫緩沖液洗脫，乙醇沉淀冋收。

4. 確定交聯(lián)位點(diǎn)

可以通過對純化的 RNA 交聯(lián)物進(jìn)行 RNase 不*消化和堿水解反應(yīng)來確定 RNA 上的交聯(lián)位點(diǎn)。片段的大小可以通過與已知序列和長度的寡核苷酸（經(jīng) RNasc T1 和 RNase B. cereus 消化的 RNA ) 進(jìn)行比較來確定。

對于大量的或結(jié)構(gòu)不穩(wěn)足的且不適于堿水解的 RNA，可以通過對純化的 RNA 交聯(lián)物進(jìn)行引物延伸分析來找到 RNA 上的精確的參與交聯(lián)的位點(diǎn)。以 RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 拷貝終止于 RNA 的修飾位點(diǎn)或交聯(lián)位點(diǎn)，通過與對照序列的比較就可以找到反轉(zhuǎn)錄的終止位點(diǎn)。

(1) 不*堿性水解反應(yīng)確定 RNA 交聯(lián)位點(diǎn)

將 32P 標(biāo)記的 RNA 分別加入兩個(gè)干凈的離心管內(nèi)，標(biāo)號 No.one，No.2； 將 RNA-蛋白交聯(lián)物加入第三個(gè)離心管，標(biāo)號 No.3。

在 No.noe 管中加入 1 μl 10X RNase 緩沖液，1 μl 0.1 U/μl 的 RNase T1 或 RNase B. cereus，加雙蒸水至 10 μl，55℃ 孵育 6~12 min 。此反應(yīng)是水解反應(yīng)的片段大小對照。

另兩管加入 1 μl 10X 水解緩沖液，再加雙蒸水至10 μl，85℃ 孵育 8 min 得到 RNA 的堿水解片段。

三管均加入了上樣緩沖液，置于冰上，于 95℃ 加熱 2 min，上樣，變性膠電泳（膠已經(jīng)以 30W 預(yù)電泳 4 h ) 至所有條帶得到充分分離。

放射自顯影。

(2) 反轉(zhuǎn)錄（引物延伸分析）法確定 RNA 交聯(lián)位點(diǎn)

此方法中通常的 RNA 或 RNA 蛋白交聯(lián)物的用量為 0.1~1 pmol （具體用量取決于 32P 標(biāo)記的 DNA 引物的活性）。

用蛋白酶 K 消化 RNA-蛋白交聯(lián)物，生成的 RNA-蛋白交聯(lián)物中的多肽僅含存較少的氨基酸：用 50 μl 蛋白酶 K 反應(yīng)緩沖液重懸從膠中純化得到的 RNA-蛋白交聯(lián)物，加入 1 μl 蛋白酶 K 儲存液（2.5 mg/ml )，于 37℃ 反應(yīng) 30 min。

乙醇沉淀 RNA-蛋白交聯(lián)物（方法同前），變性膠電泳純化 RNA 產(chǎn)物（方法同前）。

在反應(yīng)管中加入 4 pmol 未交聯(lián)的 RNA，4 pmol 32P 標(biāo)記的 DNA 引物，2 μl 5X 反轉(zhuǎn)錄緩沖液，雙蒸水補(bǔ)充體積至 10 μl。另一反應(yīng)管內(nèi)加入消化后的 RNA-蛋白交聯(lián)物，1 pmol 32P 標(biāo)記的 DNA 引物，0.5 μl 5X 反轉(zhuǎn)錄緩沖液，雙蒸水補(bǔ)充體積至 2.5 μl。75°C 退火 3 min，漸冷卻至室溫，離心收集產(chǎn)物。

分別以 G、A、C、U 和 X 標(biāo)記五個(gè)反應(yīng)管，均加 3 μl 核苷酸混合物，1 μl 5X 反轉(zhuǎn)錄緩沖液，在 G、A、C、U 各管中加入 2.5 μl 步驟(3)中未交聯(lián)的 RNA 混合液，將步驟(3)中 RNA-蛋白交聯(lián)物的混合液加入反應(yīng)管 X。

在每個(gè)反應(yīng)管中加入 1 μl ( 5 U/μl ) AMV反轉(zhuǎn)錄酶，起始延伸反應(yīng)。

室溫溫育 10 min，于 42℃ 溫育 50 min。

向每個(gè)反應(yīng)管中加入 12 μl 上樣緩沖液終止反應(yīng)，95℃ 加熱 5 min，進(jìn)行變性膠電泳。

放射自顯影。