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    Real-time PCR實(shí)驗(yàn)攻略（基本方法二）

    發(fā)布時(shí)間： 2022-03-11　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2882次

    材料與儀器

     

    一、關(guān)于Trizol Reagent需要的試劑
     
    1. Chloroform：氯仿 (分析純)
     
    2. Isoproplyl alcohol：異丙醇(分析純)
     
    3. 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析純無(wú)水乙醇并用0.01%的DEPC處理過(guò)的無(wú)Rnase的水稀釋。
     
    4. RNase-free water：無(wú)Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500 ml（50 ul），在37 ℃過(guò)夜，并高壓滅菌即得（150 ℃ 3小時(shí)）
     
    5. 一次性塑料手套
     
    6. 注意：DEPC有致癌之嫌
     
    7. 抽提出的細(xì)胞總RNA干燥后加水50 ul，取10 ul加無(wú)Rnase水990 ul，稀釋100倍成1 ml。于0.5 cm厚的石英比色杯中，以無(wú)Rnase水為對(duì)照，在721型紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)為：A260/280 ratio <1.6。
     
    8. 分離組織10 mg（純組織）加800 ul Trizol試劑。

     

     

    步驟

     

    二、DEPC處理方法如下

     

    1. DEPC處理

    （1）DEPC水：100 ml超純水加入0.2 ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。

    （2） Tip頭(槍頭）. EP管等在提RNA過(guò)程中及做RT時(shí)接觸RNA的器材（包括1 ml. 200 μl. 20 μl Tip頭；EP管和PCR反應(yīng)管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超純水加入1ml DEPC）37 ℃浸泡過(guò)夜，高壓滅菌。

     

    2. 提取RNA，用DEPC水溶解

     

    3. RT 我是用PCR儀來(lái)控制溫度和時(shí)間的，所以RT是在PCR反應(yīng)管中作的。

     

    4. 操作過(guò)程中要戴一次性手套，并經(jīng)常換手套。 最好把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處理一下，槍頭盒插好槍頭后，加入1-2 ml的0.1%DEPC水，再滅菌就行了；現(xiàn)在有進(jìn)口的RNASE FREE的槍頭買(mǎi)，直接用不用處理的。
    三、如何消除污染
     
    機(jī)器運(yùn)行完后，取出PCR產(chǎn)物時(shí)不能隨便丟棄，應(yīng)該用塑料手套或其他打結(jié)包好后丟入垃圾桶。
     
    （1） 試劑：mixer盡量分裝，不要原瓶多次取用。
     
    （2） 加樣：原則是DNA最后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那么采取的方法是算出總體積后加在一個(gè)管子里面，混合均勻之后再分裝到各個(gè)管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染。 另外，普通實(shí)驗(yàn)室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一個(gè)房間里有比較大的關(guān)系，最容易造成高濃度污染的就是產(chǎn)物的開(kāi)蓋和質(zhì)粒的稀釋。 目前，國(guó)內(nèi)外各個(gè)公司提供的診斷試劑盒大多采用了UNG來(lái)防污染。Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，來(lái)源于大腸桿菌重組克隆表達(dá)。
     
    四、RNA定量
     
    RNA也最好至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度計(jì)比較不同標(biāo)本之間就更不準(zhǔn)了。 RNA的貯藏，最主要的是溫度，-20不夠，最好-80，液氮最保險(xiǎn) mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因?yàn)檫€有翻譯效率和RNA降解速度的影響。
     
    五、RT-PCR有兩種做法
     
    條件具備的話可用kit進(jìn)行一步法進(jìn)行；若條件不太好的話可分兩步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再PCR。但后來(lái)發(fā)現(xiàn)兩步法的結(jié)果更加理想，條帶特異性強(qiáng)且無(wú)拖尾現(xiàn)象，我推測(cè)是體系更加單一比較利于PCR的進(jìn)行 一定要做內(nèi)參的，每一次，我想。不作內(nèi)參的結(jié)果是不可信的 電泳可以不一起跑，沒(méi)有關(guān)系，計(jì)算的是相對(duì)表達(dá)程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對(duì)表達(dá)量，不是絕對(duì)表達(dá)量。
     
    六、mRNA的分離與純化
     
    步驟（4）中將RNA溶液置65 ℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個(gè)，一個(gè)是破壞RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個(gè)目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會(huì)導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。
     
    七、下面，我們介紹一個(gè)可以確認(rèn)RNA溶液中有沒(méi)有殘留的RNA酶的方法：
     
    保溫試驗(yàn)方法很簡(jiǎn)單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1 000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補(bǔ)充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70 ℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20 ℃冰箱中保存1 h。 時(shí)間到了之后，取出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無(wú)明顯差別（當(dāng)然，它們的條帶也要符合方法2中的條件）， 則說(shuō)明RNA溶液中沒(méi)有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。相反的，如果70 ℃保溫的樣本有明顯的降解，則說(shuō)明RNA溶液中有RNA酶污染。
     
    八、PCR污染與對(duì)策
     
    1.  PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染
     
    這是PCR反應(yīng)中最主要常見(jiàn)的污染問(wèn)題，所以，擴(kuò)增區(qū)的儀器什么如槍頭等要注意。 還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題。
     
    1)標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備；
     
    2)PCR擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增；
     
    3)產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。
     
    各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。 切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度。
     
    2.  反應(yīng)液污染 可采用下列方法之一處理：
     
    1)DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5 U DNase I，室溫反應(yīng)30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA的序列；
     
    2)尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于UV照射的去污染作用對(duì)500 bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測(cè)的PCR擴(kuò)增片段通常為300 bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。
     
    a、提取mRNA時(shí)所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干，高壓滅菌，再烘干。
     
    b、用DEPC水洗過(guò)后當(dāng)然不能用雙蒸水洗了。那你用DEPC處理還有什么意義呢？還要用雙蒸水洗嗎？
     
    c、玻璃器皿干烤：180度，8小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間；小器皿也可以用少許氯仿處理一下。另外，鐵制品、研砵等也可倒上酒精直接燒。
     
    RNA提取
     
    一、RNA提取前的準(zhǔn)備
     
    1.  研缽的處理
     
    1) 自來(lái)水反復(fù)沖洗；
     
    2) 去污劑或者洗滌靈沖洗；
     
    3) 自來(lái)水反復(fù)沖洗；
     
    4) 蒸餾水浸泡1~2d；
     
    5) 超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)水乙醇沖洗2~3遍，晾干。（在RNA提取前，紫外殺菌10min）
     
    2.  槍頭及EP管的處理
     
    1) 0.1%DEPC水浸泡1~2w；
     
    2) 用鑷子夾起槍頭一一裝入槍頭盒中，用鑷子夾起EP管放入飯盒中；
     
    3) 高壓滅菌50min，45度烘箱烘干。
     
    二、RNA的提取
     
    Trizol法適用于人類(lèi)、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA*蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。
     
    在收集到生物材料之后，最好能即刻進(jìn)行RNA制備工作。若需暫時(shí)儲(chǔ)存，則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后，儲(chǔ)存于-80 ℃冷凍柜。在制備RNA時(shí)，將儲(chǔ)存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細(xì)胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。
     
    1.  將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg組織加入1 ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%；提取細(xì)胞RNA時(shí)，先離心沉淀細(xì)胞，每5-10×106個(gè)細(xì)胞加1 ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞；
     
    2.  將上述組織或細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫15~30 ℃下放置5分鐘；然后以每1 mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。 在室溫下（15 ℃～30 ℃）放置2～3分鐘后，12000 g（2 ℃～8 ℃）離心15分鐘；
     
    3.  取上層水相（離心后，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、上層為無(wú)色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當(dāng)于所加的Trizol試劑量的60%）于一新的離心管，按每1 mlTrizol液加0.5 ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫（15 ℃～30 ℃）放置10分鐘，12000 g（2 ℃～8 ℃）離心10分鐘。
     
    4.  棄去上清液（RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁），按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混勻，4 ℃下7500 g離心5分鐘。
     
    5.  小心棄去上清液，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。
     
    6.  加適量Rnase-free water 溶解RNA沉淀（60 ℃ 10 min）。-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/div> 
    7.  RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70 ℃。
     
    [注意]
     
    1.  整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然會(huì)有蛋白質(zhì)污染，影響比值。
     
    2.  加氯仿前的勻漿液可在-70 ℃保存一個(gè)月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4 ℃保存一周，-20 ℃保存一年。
     
    在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA提取過(guò)程中注意避免mRNA 的斷裂；取2 ug進(jìn)行RNA檢測(cè)，如果存在DNA污染時(shí)，要用DNase I進(jìn)行消化（因?yàn)樵谔幚磉^(guò)程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑。

     

    注意事項(xiàng)

     

    北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院心外科心血管病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室吳益和分享
     
    實(shí)驗(yàn)中必須堅(jiān)持的一些好習(xí)慣
     
    1. 加入試劑之前，把它混勻一下，以免放置時(shí)間長(zhǎng)了濃度不均。
     
    2. 移液槍用完之后要?dú)w到最大計(jì)量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性。
     
    3. 所有的試劑都自己配，出了問(wèn)題才好找原因一. 防止RNA酶污染的措施。
     
    一、防止RNA酶污染的措施
     
    1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180 ℃的高溫下干烤6 h或更長(zhǎng)時(shí)間。
     
    2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
     
    3. 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10 min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
     
    4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37 ℃處理12 h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。
     
    5. 操作人員戴一次性口罩. 帽子. 手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。
     
    6. 設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。
     
    動(dòng)植物總RNA提取-Trizol法
     
    Trizol法適用于人類(lèi). 動(dòng)物. 植物. 微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA*蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。
     
    在收集到生物材料之后，最好能即刻進(jìn)行RNA制備工作。若需暫時(shí)儲(chǔ)存，則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后，儲(chǔ)存于-80 ℃冷凍柜。在制備RNA時(shí)，將儲(chǔ)存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細(xì)胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。
     
    1. 將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg組織加入1 ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%；提取細(xì)胞RNA時(shí)，先離心沉淀細(xì)胞，每5-10×106個(gè)細(xì)胞加1 ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞； 2. 將上述組織或細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫15~30 ℃下放置5分鐘；然后以每1 mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。 在室溫下（15 ℃～30 ℃）放置2～3分鐘后，12 000 g（2 ℃～8 ℃）離心15分鐘； 3. 取上層水相（離心后，混合物將分離為底層為淺紅的. 中層為酚-氯仿相. 上層為無(wú)色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當(dāng)于所加的Trizol試劑量的60%）于一新的離心管，按每1 mlTrizol液加0.5 ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫（15 ℃～30 ℃）放置10分鐘，12 000 g（2 ℃～8 ℃）離心10分鐘?！救绻Ｍ蛛xDNA或蛋白質(zhì)，保留中層和下層酚-氯仿相，有機(jī)相能保存在4°C一夜】
     
    4. 棄去上清液（RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁），按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混勻，4 ℃下7 500 g離心5分鐘【RNA能夠在-20 °C保存在75%乙醇中至少1年，4°C保存至少1周】
     
    5. 小心棄去上清液，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)使RNA失去溶解性，導(dǎo)致A260/280 ratio <1.6。
     
    6. 加適量Rnase-free water 溶解RNA沉淀，用槍頭反復(fù)吸取混勻，55-60 ℃水浴10-15 min。進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)或-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/div> 
    7. RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70 ℃。
     
    預(yù)計(jì)的總RNA產(chǎn)量：
     
    [注意]
     
    1. 整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然會(huì)有蛋白質(zhì)污染，影響比值 2. 加氯仿前的勻漿液可在-70 ℃保存一個(gè)月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4 ℃保存一周，-20 ℃保存一年。

     

     

    同實(shí)驗(yàn)其他方法

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