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    哺乳動物細(xì)胞抽提物中熒光素酶的測定實驗

    發(fā)布時間: 2021-12-16  點擊次數(shù): 1276次

    原理


    螢光素酶是理想的報告基因,因為哺乳動物細(xì)胞中不含內(nèi)源性螢光素酶,一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶,同時在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中,它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率,檢測靈敏度高。熒光素酶報告基因被廣泛用于miRNA靶基因驗證。


    熒光素酶報告基因的原理在于miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用,可以將目的基因3’UTR區(qū)域構(gòu)建至pGL3-basic載體中報告基因Luciferase的后面,構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,通過比較過表達或者干擾miRNA后,檢測報告基因表達的改變(監(jiān)測螢光素酶的活性變化)可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用。結(jié)合定點突變等方法進一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。


    材料與儀器

    DNA 轉(zhuǎn)染的哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞
    細(xì)胞裂解緩沖液 熒光素酶測定緩沖液 熒光素溶液 不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液
    熒光光度計和光度計測置管 橡膠棒

    步驟


    1. 轉(zhuǎn)染后 24-72 h, 室溫下用不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液(PBS) 洗細(xì)胞 3 次。PBS 換液時要輕緩,因為有些哺乳動物細(xì)胞(如人胎腎 293 細(xì)胞)在劇烈吹打時很容易從培養(yǎng)皿上脫落下來。通常,熒光素酶基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中獲得最大表達量的時間是 24-72 h。


    2. 每個 100 mm 培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)染細(xì)胞,加入 lml 冰冷的裂解緩沖液。緩沖液輕輕旋轉(zhuǎn), 然后用橡膠棒把裂解細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下來。細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到 1.5 ml 離心管中。


    3. 細(xì)胞裂解物在 4°C 以最大速度離心 5 min。把上清小心地轉(zhuǎn)移到另一個新的 1.5 ml 離心管中。


    4. 用 Bradford 測定等快速比色法確定裂解物的蛋白濃度。在測定蛋白濃度前,為了防止干擾,把 TritonX-100 的濃度稀釋到小于等于 0.1%。這步中,細(xì)胞裂解液可以分成小份, 貯存在-70°C。雖然貯存在或-20°C 時,熒光素酶在裂解緩沖液中不穩(wěn)定(Brasier et al.1989), 但是在含 15%(V/V)甘油和 1%(m/V) 牛血淸白蛋白的緩沖液中,該酶可以在 4°C 安全貯存。


    5. 敲打盛有裂解物的管子的管壁,輕輕使裂解物混合。室溫下,在每個含有 360ul 熒光素酶測定緩沖液的熒光光度計管中加入 5-200ul 細(xì)胞裂解液。管子放入熒光光度計。


    除了可使用熒光光度計測量熒光素酶活性,還有另一種方法在欄目替代方案:用閃爍計數(shù)器測量熒光素酶活性。


    6. 測定開始,200ul 熒光素溶液加到熒光光度計管中,然后在室溫測量 2-60s 時間內(nèi)的光輸出。測光輸出時間的最佳長短要根據(jù)經(jīng)驗確定,而且與轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類型以及所用的特殊底物和熒光素酶有關(guān)。


    7. 測定每個管子產(chǎn)生的相對光單位數(shù),并確定測量的線性范圍。使用適當(dāng)量的細(xì)胞裂解蛋白,使它在隨后測量中產(chǎn)生的值位于線性范圍的中部。根據(jù)所研究啟動子的強度以及每次實驗的轉(zhuǎn)染效率,所需蛋白的量會有變化。細(xì)胞裂解物中熒光素酶活性可以用相對光單位數(shù)或毫克表示。



    注意事項

    熒光素是能夠受熒光素酶催化發(fā)光的底物的通稱。常用的熒光素酶基因來自螢火蟲,它作用于特定的熒光素底物。其他如來自海三色堇或某種海洋細(xì)菌的熒光素酶所使用的熒光素底物具有不同的化學(xué)性質(zhì)。確定前面緩沖液中所用的熒光素底物確實與表達質(zhì)粒中的熒光素酶基因相匹配。

    常見問題

    為了減少內(nèi)在的變化因素,比如:培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等對實驗準(zhǔn)確性的影響,將帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,提供轉(zhuǎn)錄效率的內(nèi)對照,使測試結(jié)果不受實驗條件變化的干擾。在測量過程中,首先加入熒光素酶檢測試劑時產(chǎn)生螢火蟲熒光信號,這樣先測量螢火蟲熒光素酶活性。定量螢火蟲熒光強度之后,再在同一樣品中加入Stop&Glo Reagent試劑,將上述反應(yīng)淬滅,并同時啟動海腎熒光素酶反應(yīng),進行第二次測量,稱之為雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐?br style="border: 0px solid; box-sizing: border-box; --tw-shadow:0 0 #0000; max-width: 100%; background-image: none !important; background-position: initial !important; background-size: initial !important; background-repeat: initial !important; background-attachment: initial !important; background-origin: initial !important; background-clip: initial !important; color: rgb(77, 88, 101) !important; font-size: 0.32rem !important; line-height: 0.5rem !important; margin: 0px !important;"/>

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