-
CAT活性的層析分析法
發(fā)布時(shí)間: 2021-12-14 點(diǎn)擊次數(shù): 949次材料與儀器
DNA
PBS 乙酸乙酯 氯仿 甲醇 Tris·Cl
薄層層析缸 濾紙 離心管 離心機(jī)步驟
1. 100 mm 培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)染了CAT表達(dá)質(zhì)粒的貼壁細(xì)胞,用PBS洗兩次,每次5 ml每培養(yǎng)皿加入1 ml TEN溶液。將細(xì)胞置于冰浴5 min。
2. 用橡膠細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下來,將其轉(zhuǎn)入一只1.5 ml 的微量離心管中,置于冰浴5 min。
3. 在4℃以最大離心速度離心細(xì)狍1 min,細(xì)胞沉淀重懸于100 μl 冰冷的0.25 mol/l 的pH7.5的Tris·Cl緩沖液中。
4. 在干冰/乙醇中凍結(jié)細(xì)胞5 min,移至37℃融解5 min。重復(fù)這種凍融過程兩次以上。
5. 在冰上冷卻細(xì)胞裂解液,然后,4℃以最大離心速度離心5 min。移出并保留上清(細(xì)胞提取物),置于- 20℃凍存。6. 在下面混合液中分析20 μl 細(xì)胞提取液2 μl 200 μCi/ml [14C]氯霉素
20 μl 4 mmol/l 乙酰輔酶A
32.5 μl 1 mol/l Tris·Cl,pH7.5
75.5 μl H2O7. 對(duì)于每組分析,在微量離心管中加130 μl 上述混含液和20 μl 提取液,輕輕混勻。 37℃溫育1 h。8. 加1 ml 乙酸乙酯至反應(yīng)液中,在漩渦混合器上混勻。離心1 min,移出上層液相(乙酸乙酯)在Speedvac蒸發(fā)器中蒸干乙酸乙酯45 min。
9. 薄層層析缸的平衡:在缸中加入190 ml 氯仿,10 ml 甲醇,及一張與TLC薄層平板大小大致相等的Whatman 3MM 濾紙,靜置2 h。
10. 將毎個(gè)樣品重懸于30 μl 乙酸乙酯中,點(diǎn)樣,在TLC薄板邊緣之上約2 cm 處,每樣5 μl。11. 在盛有200 ml 19:1氯仿/甲醇的平衡過的層析缸中展開色譜,進(jìn)行2 h 或至溶劑的前沿接近薄板的頂部為止。取下TLC薄板,在空氣中晾干。用放射性墨水筆作上標(biāo)記后,用塑料薄膜包裹,置于感光片上進(jìn)行放射自顯影。
12. 切出各顯影點(diǎn)相應(yīng)的薄層塊放入閃爍液中計(jì)數(shù),先測(cè)定出各單乙酰氯霉索的計(jì)數(shù)值所占的百分?jǐn)?shù)而計(jì)算提取物的活性,按下列公式計(jì)算的活性:同實(shí)驗(yàn)其他方法
原位裂解細(xì)胞的CAT分析法
1. 60 mm 培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染了CAT表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞,用2 ml PBS洗1次。每培養(yǎng)皿加入2 ml 低滲緩沖液,在室溫下溫育2~5 min。 2. 吸去低滲緩沖液,加入400 μl T
CAT活性的相-抽提分析法
一、來源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞 1. 按“CAT活性的層析分析法"中的步驟1~5的凍融法,制備哺乳動(dòng)物細(xì)胞提取物。如果用胰蛋白酶消化或制細(xì)胞方法來收集細(xì)胞,則將原位裂解法的步驟1至4用以下的步驟2
人生長(zhǎng)激素的放射免疫分析法
1. 取轉(zhuǎn)染了hGH表達(dá)質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)液100~500 μl。 2. 加100 μl 培養(yǎng)液或標(biāo)準(zhǔn)品至12 mm×75 mm 圓底試管中。加入100 μl 125I-
以上就是本期的內(nèi)容,更多資訊,歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
安培生物科技有限公司介紹:
安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究、活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶,提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑;inviCELL™Platelet lysate無動(dòng)物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn),包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等,為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù);提供以植物生物為平臺(tái)基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品;提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對(duì)細(xì)胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù),努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。
-
血清系列
-
細(xì)胞轉(zhuǎn)染
-
支原體清除
-
細(xì)胞凍存
-
實(shí)驗(yàn)耗材
-
分子試劑
-
細(xì)胞增殖與凋亡
-
Biozellen系列
-
培養(yǎng)基
-
ELISA試劑盒
-
TOYOBO(東洋紡)
-
ZYMO RESEARCH
-
Greiner(格瑞納)
-
IKA(艾卡)
-
化學(xué)發(fā)光底物(ECL)
-
PROSPEC系列
-
Epigentek系列
-
微生物檢測(cè)
-
細(xì)胞生物學(xué)
-
Corning康寧
-
解離試劑
-
細(xì)胞類-實(shí)驗(yàn)耗材
-
原代細(xì)胞
-
植物檢測(cè)系列試劑盒
-
SERANA
-
細(xì)胞系
-
生化試劑盒
-
環(huán)境檢測(cè)系列試劑盒(AKEN)
-
類器官培養(yǎng)
-
緩沖器和解決方案
-
生物三凝膠基質(zhì)
-
細(xì)胞因子分子
-
生物樣本庫