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    細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及解答(三)

    發(fā)布時(shí)間: 2021-12-09  點(diǎn)擊次數(shù): 1307次

    本期分享第三期的細(xì)胞培養(yǎng)常見問題的內(nèi)容,希望對(duì)大家有所幫助啦~


    20. 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí),應(yīng)如何處理?

    原則上:直接滅菌后丟棄之。

    當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí),研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母,把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開,用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái),檢查HEPA過濾器。

    高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性,因而,做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。

    (1)  在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞,稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。

    (2)  分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi),把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

    (3)  每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo),如脫落,出現(xiàn)空泡,匯合度下降和變圓。

    (4)  確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2~3代。

    (5)  在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

    (6)  重復(fù)步驟4。

    (7)  在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~6代,確定污染是否以已被消除。

     



    21. 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞, 是否能以肉眼觀察出異狀?

    不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外,大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株,無法以其外觀分辨之。

     



    22. 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響?

    支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞的生長(zhǎng)參數(shù),代謝及研究的任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義。

     



    23. 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí), 該如何處理?

    直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細(xì)胞株,但是如果您的樣本珍貴,建議您使用支原體去除試劑去除污染



    24. CO2 培養(yǎng)箱的水盤如何保持清潔?

    定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

     



    25. 為何培養(yǎng)基保存于4℃ 冰箱中, 顏色會(huì)偏暗紅色,且pH值會(huì)越來越偏堿性?

    培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中,培養(yǎng)基內(nèi)的CO2會(huì)逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果,將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí),可以通入無菌過濾的CO2,以調(diào)整pH 值。

     



    26. 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish,flask是否均相同?

    不同廠牌的dish 或flask,其所coating 的polymer 不同,制造程序亦不同,雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響,惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同的dish 或flask 而有顯著的生長(zhǎng)差異。

     



    27. 購(gòu)買的細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少的情形?

    研究人員在冷凍細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少,大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤,造成細(xì)胞的物理性損傷,以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

     



    28. 購(gòu)買的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因?

    研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳,常見原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后,加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于-80℃太久。

     



    29. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?

    我們建議您在使用血清的時(shí)候,注意下列的操作:

    (1)  解凍血清時(shí),請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫),若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃),非常容易產(chǎn)生沉淀物。

    (2)  解凍血清時(shí),請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發(fā)生。

    (3)  請(qǐng)勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清會(huì)變得混濁,同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害,而影響血清的質(zhì)量。

    (4)  血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無須做此步驟。

    (5)  若必須做血清的熱滅活,請(qǐng)遵守56℃,30分鐘的原則,并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過高,時(shí)間過久或搖晃不均勻,都會(huì)造成沉淀物的增多。

     



    30.  L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?

    L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

     



    31.  GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I?這個(gè)二肽有多穩(wěn)定?

    GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。

    GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,即使在121℃滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎*降解。

     



    32. 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?

    酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細(xì)胞,尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),不用加。


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