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    大鼠星型膠質(zhì)細胞培養(yǎng)實驗——酶消化法

    發(fā)布時間: 2021-12-05  點擊次數(shù): 1138次

    材料與儀器

    Wistar大鼠乳鼠
    FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精
    眼科剪 滴管 離心機 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱

    步驟

    一、實驗步驟

    1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠,經(jīng)75%酒精消毒,斷頭處死。
     
    2. 取腦放入冷的D-Hanks'平衡鹽溶液,去除腦膜及大血管。
     
    3. 分離兩側(cè)大腦皮質(zhì)并剪成1mm3 大小,加入0.25%胰蛋白酶37℃空氣浴震蕩消化10 min。
     
    4. 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化,離心(1 000 rpm,10 min),去上清。
     
    5. 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀,經(jīng)75μm篩網(wǎng)過濾,收集濾液,再次離心10 min,收集沉淀用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細胞密度至1.5x106/ml,種植于75 cm2 培養(yǎng)瓶。
     
    6. 經(jīng)1 小時差速黏附去除成纖維細胞后,將細胞懸液轉(zhuǎn)移到一新的75 cm2 培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng),兩天換液一次。
     
    7. 7 天后將培養(yǎng)瓶放入水平搖床(260 rpm,2 h,37℃),換液棄除小膠質(zhì)細胞,放入培養(yǎng)箱平衡1 小時,重新置于水平搖床18 h。
     
    8. 換液棄除少突膠質(zhì)細胞,用新鮮培養(yǎng)基洗2 遍,加入0.25%胰蛋白酶與0.02% EDTA 1:1 混合液消化、傳代備用。
     
    二、 形態(tài)學(xué)觀察

    倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀況。
     
    三、 細胞生長曲線繪制

    傳代后的細胞以 2x104/ml 的密度種植于24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),3 天換液1 次, 每24 小時取3 孔計數(shù),連續(xù)7 天,取均值繪制生長曲線。
     
    四、星型膠質(zhì)細胞的鑒定

    膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞組織化學(xué)鑒定方法。取星型膠質(zhì)細胞去除培養(yǎng)基,用PBS洗3 遍,4%多聚甲醛室溫固定1 小時,PBS洗3 次,每次5 分鐘,0.3% H2O2 30 分鐘以去除內(nèi)源性過氧化物,PBS洗3 次每次5 分鐘,加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封閉30 分鐘,滴加兔抗GFAP 抗體(1:75),4℃ 18 小時,PBS洗3 次每次5 分鐘,滴加生物素標記羊抗兔IgG,室溫20 分鐘,PBS洗3 次,每次5 分鐘,滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,室溫20 分鐘,PBS洗3 次,每次5 分鐘,DAB顯色。
     五、結(jié)果

    1. 形態(tài)學(xué)觀察:光鏡下,傳代的星型膠質(zhì)細胞折光性強,形狀不規(guī)則,主要為多角形,胞體大而扁平、胞質(zhì)豐富,細胞核圓形或卵圓形,偏于胞體一側(cè),內(nèi)有1-2 個核仁,有多個粗短枝狀初級胞突,部分細胞突起變細變長,6-7 天后細胞融合成單層,符合神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長特性,如下圖。
     

    星型膠質(zhì)細胞單層生長(x100)

    圖1:星型膠質(zhì)細胞形成融合狀,單層生長(x200)
     
    2.  鑒定:細胞經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均為細胞漿著色,而胞核未見著色,見下圖,證明采用上述方法獲得的細胞為星型膠質(zhì)細胞,純度高, 可用于實驗。

    圖2:免疫組化鑒定,GFAP 染色

    3. 細胞生長曲線繪制如下:

    圖3:細胞生長曲線


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