銷售熱線

19126518388
  • 技術文章ARTICLE

    您當前的位置:首頁 > 技術文章 > 如何從培養(yǎng)細胞中制備細胞核基質/中間纖維骨架結構?

    如何從培養(yǎng)細胞中制備細胞核基質/中間纖維骨架結構?

    發(fā)布時間: 2021-11-18  點擊次數: 824次

    材料與儀器

    細胞
    Tritron X-100 抽提緩沖液
    電子顯微鏡

    步驟

    1. 在 4℃ 用 PBS 洗細胞一次。

    2. 在 4℃ 用含 0.5% Tritron X-100 的細胞骨架緩沖液抽提細胞 3 到 5 分鐘。直到消化步驟,每 107 個細胞最少要用 1 ml 緩沖液,以后減半。

    3. 在 4℃ 用抽提緩沖液抽提細胞 3~5 分鐘。這一步去除組蛋白 H1 和除中間纖維蛋白之外的細胞骨架蛋白。另外,這一步也可在 DNA 酶消化步驟(第 4 步)之后作,這樣也不會引起超微結構的變化。

    抽提緩沖液:

    10 mmol/L PIPES,pH 6.8

    250 mmol/L 硫酸銨

    300 mmol/L 蔗糖

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EDTA

    4. 在含 0.5% Triton X-100 的消化緩沖液中用無 RNA 酶的 DNA 酶消化以去除染色質 DNA 酶濃度為 200~400 單位/ml,32℃ 反應 30~50 分鐘。

    含 0.5% Triton X-100 的消化緩沖液:

    10 mmol/L PIPES,pH 6.8

    300 mmol/L 蔗糖

    50 mmol/L NaCl

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    5. 用抽提緩沖液清洗樣品兩次,每次 5 分鐘。

    6. (可選)樣品在 4℃ 用 2 mol/L NaCl 抽提 3~5 分鐘。這一步能使可能形成核基質核心的 10 nm 纖絲分支顯形(Jackson and Cook 1988; He et al, 1990)。在第 4 步中用 Hae Ⅲ 和 Pst Ⅰ(每種酶 400 單位/ml)代替 DNA 酶 Ⅰ 可以使核心纖絲保存的更好。

    2 mol/L NaCl 緩沖液:

    10 mmol/L PIPES,pH 6.8

    300 mmol/L 蔗糖

    2 mol/L NaCl

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    7. 固定核基質以進行免疫熒光檢測或電子顯微鏡檢測。


產品中心 Products