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從成年骨骼肌分離和培養(yǎng)成肌細胞的方法步驟
發(fā)布時間: 2021-11-15 點擊次數(shù): 1474次材料與儀器
D-PBSA
轉(zhuǎn)運培養(yǎng)液 生長培養(yǎng)液 鏈酶菌蛋白酶液
尼龍網(wǎng) 手術(shù)刀 鋒利的長剪刀 Petri培養(yǎng)皿 培養(yǎng)瓶 20ml離心管或一般容器 血細胞計數(shù)板步驟
一、分離
1. 用手術(shù)刀切除活檢組織塊上的非肌性組織,然后用 D-PBSA 浸洗。
2. 稱重前,與肌纖維平行將切除活檢組織切成片,用沖洗。
3. 將組織片平行放入 Petri 培養(yǎng)皿蓋內(nèi),切成較薄的柱狀組織塊,然后切成 1 mm3 小塊。不要擠壓組織。也可在試管內(nèi)用長剪刀將組織剪成小塊,應(yīng)避免擠壓組織。
4. 用 D-PBSA 浸洗組織塊,靜置后吸去上清液。
5. 在 37°C 條件下,用鏈酶菌蛋白酶液(0.15 % 鏈酶菌蛋白酶(Sigma P-6911)、0.03% EDTA(Merck 8418)、20 IU/ml 青霉素和 20 μg/ml 鏈霉素(0.4% Eurobio PES3000),用 Ham F12 或 D-PBSA 配制,100ml)消化組織塊 1 h。每 1~3 mg 組織塊用 15 ml 鏈酶菌蛋白酶液。每間隔 10~15 min 輕輕搖晃試管。
6. 孵育后用吸管研磨組織塊。由于越來越多的細胞分離下來,培養(yǎng)液會逐漸變得渾濁。
7. 讓組織塊沉到試管的底部,形成沉降的組織塊(P1 ) 和上清液(S1)。
8. 用孔徑為 100 μm 的尼龍網(wǎng)將 S1 濾入 20 ml 離心管。輕輕搖晃或用吸管吹打上清液,使細胞混懸。
9. 離心(350 g,8~10 min)后,吸去上清液。
10. 準確加入 10 ml 生長培養(yǎng)液(Ham F12,添加 20 % FBS (Gibco 011-06290),200 ml),用帶有橡皮吸頭的吸管很輕微地混懸細胞。然后,用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞。
11. 用生長培養(yǎng)液稀釋細胞懸液,以約 1.5×104 個/ml 的細胞密度將細胞接種于培養(yǎng)瓶。從 1 g 健康供體活檢組織約獲得 1~2×105個細胞。
12. 將 15 ml 消化液加入 P1,在 37°C 水浴中孵育組織塊 30 min,并定時搖晃。
13. 用吸管吹打細胞懸液,使細胞分散。然后,用尼龍網(wǎng)過濾細胞懸液。用 20 ml 生長培養(yǎng)液浸洗濾網(wǎng)。
14. 離心(350 g,8~10 min)后,計數(shù)細胞,按上述方法接種細胞。
15. 將培養(yǎng)瓶移入濕潤的培養(yǎng)箱,在 37°C 和 5 % CO2 的條件下培養(yǎng)細胞。
二、維持培養(yǎng)
16. 接種后 24 h 很輕微地換培養(yǎng)液,以后每 3~4 d 換液 1 次。細胞主要向著分化生長。人成肌細胞的生長分 3 期,培養(yǎng)后 4~6 d 增殖達髙峰;8 d 左右排列成行;10~12 d 細胞融合和形成肌管增多。然而,必須記住一些細胞可能分化較早,絕大多數(shù)細胞分化時一些細胞仍處于增殖狀態(tài)。
三、傳代培養(yǎng)
17. 將少量 EDTA 輕輕注在細胞上面后立即吸去。
18. 加入 0.25 % 胰蛋白酶液,足以在細胞上面形成一薄層。
19. 當(dāng)細胞去附著時,加入 5~10 ml *生長培養(yǎng)液,用吸管很輕微地吹打細胞,然后離心(350 g,10 min)。
20. 計數(shù)細胞,按一定密度種植細胞。
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