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成纖維細胞飼養(yǎng)層實驗步驟
發(fā)布時間: 2021-11-05 點擊次數(shù): 1462次材料與儀器鏈酶蛋白酶E 用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA 受精后8h的胚胎 FBS
LDF基礎(chǔ)培養(yǎng)液 LDF原代培養(yǎng)液 LDF維持培養(yǎng)液 D培養(yǎng)液 Holtfreter緩沖液
培養(yǎng)瓶實驗步驟鱒魚胚胎提取物:
(a)收集胚胎(受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鱒魚種系,在 10°C 條件下飼養(yǎng),或者受精后 3 天的斑馬魚,在 28°C 條件下飼養(yǎng)),在 -80°C 條件下凍存
(b)為了制備提取物,將約 150 g 胚胎融化后,采用 Tissuemizer 勻漿器(Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上勻漿 2 min
(c)將勻漿通過數(shù)層紗布過濾后去除絨毛膜,然后在 4°C 條件下離心(20000 g,30 min )
(d)離心后收集上清液,留下表面的亮橘色脂層
(e)將上清液移入 1 只新離心管,按操作步驟(c ) 離心
(f)收集上清液,留下剩余的脂質(zhì),然后在 4°C 條件下超速離心(100000 g,60 min )
(g)超速離心后收集上清液,留下脂層。用 LDF (1 : 10 ) 稀釋上清液,然后過濾除菌
(h)提取物過一系列濾器(1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )過濾
(i)將提取物按 0.5 ml 分裝后,在 -80°C 條件下凍存
(j)為了用提取物培養(yǎng)細胞,測量蛋白質(zhì)濃度(見方案 21.4 ),然后用 LDF 將提取物稀釋至理想的工作濃度
(k)將稀釋的提取物在 4°C 條件下冷藏,最長 2 個月
BRL 細胞條件培養(yǎng)液:
(a)在 37°C 條件下和在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中,用 DMEM/F12/10FB 培養(yǎng)液培養(yǎng) BRL 細胞(ATCC )
(b)當細胞匯合時,用添加 2% FBS 的 LDF 置換 FD 培養(yǎng)液,在 37°C 條件下培養(yǎng)
(c)5 天后吸出 LDF,過濾,在 -20°C 凍存
(d)向細胞中加入新鮮的 LDF,5 天后重復(fù)此過程。條件化的 LDF 培養(yǎng)液可從同一個培養(yǎng)瓶中收集 3 次。然后,將細胞分開培養(yǎng),使細胞再次匯合
1. 收集約 30 個受精后 8 h 的胚胎。
2. 通過鏈酶蛋白酶處理,除去絨毛膜 [ Sun et al.,1995a ]。
3. 用胰蛋白酶孵育胚胎 1 min,同時用吸管輕輕吹打,以便使細胞分散。
4. 加入 FBS (終濃度為 10 % ) ,終止胰蛋白酶的消化。
5. 離心(500 g ,10 min ) ,收集細胞。
6. 用 5 ml 含有 PGF 的 LDF 原代培養(yǎng)液混懸細胞,然后將細胞移入 25 cm2 培養(yǎng)瓶。
7. 在 26°C 條件下,讓細胞貼壁和匯合。
8. 當細胞匯合時,用同樣的培養(yǎng)液傳代。
9. 培養(yǎng) 2~3 代后,上皮細胞和成纖維細胞將混合出現(xiàn)。這些細胞可用含有 10% FBS 的 LDF 基礎(chǔ)培養(yǎng)液維持培養(yǎng)。通過不同的胰蛋白酶消化,為下一步培養(yǎng)篩選成纖維細胞。
(a)用胰蛋白酶處理細胞 1 min 以除去大部分成纖維細胞,保留貼在瓶壁上的上皮細胞。
(b)將成纖維細胞移入另 1 個培養(yǎng)瓶。當細胞匯合時,重復(fù)以上過程。
(c)培養(yǎng) 2~3 代后,細胞均為成纖維細胞。
10. 制備生長抑制的成纖維細胞飼養(yǎng)層:
(a)將細胞加入合適的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶,使成纖維細胞生長成為匯合的單層。
(b)將 10 μg/ml 絲烈霉素 C 加入成纖維細胞中,在 26°C 條件下處理 3 h。
(c)用 LDF 浸洗 3 次后,可將生長抑制的成纖維細胞用作斑馬魚胚細胞培養(yǎng)的伺養(yǎng)層。
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