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表皮角質(zhì)形成細胞模型構(gòu)建實驗方法
發(fā)布時間: 2021-11-05 點擊次數(shù): 1316次材料與儀器皮膚組織
熱解素 胰蛋白酶 SKDM 角質(zhì)形成細胞生長培養(yǎng)液 D-PBSA EDTA 分析級甘油 dispase
低溫保存管 尼龍網(wǎng) 離心管 細胞過濾器 手術(shù)刀 彎鑷實驗步驟一、材料
無菌
實驗前 3 天制備飼養(yǎng)層(見方案 23.4)。照射 3T3 細胞(30 Gy) 和人成纖維細胞(70 Gy),最好用含較多細胞的懸液
FAD:Wu 等 [1982] 研制的一種用于飼養(yǎng)層培養(yǎng)的高鈣培養(yǎng)液,含有 Ham's F12、DMEM 和添加物。Ham F12 和 DMEM 混合培養(yǎng)液(1:3) 添加 1.8Xl0-4mol/L 腺嘌呤、10-10mol/L 霍亂毒素、1~10ng/L EGF、0.4ug/ml 氫化可的(木公)、5%~10% FCS、100U/ml 青霉素和 50ug/ml 鏈霉素
角質(zhì)形成細胞生長培養(yǎng)液(keratinocytegrowth medium,KGM ): 基于 Boyce 和 Ham [1983] 研制的 MCDB153 培養(yǎng)液的無血清培養(yǎng)液(見表 10.1 和附錄Ⅱ),添加低鈣(0.03~0.5 mmol/L ) 牛垂體提取物??杉尤?CaCl2,以升高鈣離子濃度
角 質(zhì)形成細胞限定培養(yǎng)液(keratinocyte-definedmedium,KDM ) : 基于 Boyce 和 Ham 于 1983 年研制的 MCDB153 培養(yǎng)液的無血清培養(yǎng)液(見附錄 1),是化學成分限定性培養(yǎng)液,Stark 等 [1999] 曾在器官型培養(yǎng)試用過
SKDM(supplemented KDM ):
(a) 不含垂體提取物的 KDM (Promocell、Clonetics);
(b) 添加 5ug /ml 胰島素、0.5ug/ml 氫化可的(木公)、0.1ng /ml rhEGF 、20ug/ml
轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.1% 髙純度血清白蛋白(無內(nèi)毒素和脂肪酸,如 A-8806,Sigma) 和 50ug/ml 抗壞血酸;
(c) 調(diào)整鈣離子濃度至 1.3 mmol/L ;
(d ) 原代角質(zhì)形成細胞可用未包被的塑料培養(yǎng)皿在 SKDM 中培養(yǎng),然而細胞增殖活性較低。將角質(zhì)形成細胞接種在涂有 I 型膠原蛋白的培養(yǎng)皿上時,生長情況可得到改善。
在含有成纖維細胞的膠原凝膠上作器官培養(yǎng)時,SKDM 對表皮生長和分化的作用與 FAD 的作用無區(qū)別
D-PBSA
0.5% EDTA(約 15 mmol/L )
分析級甘油
添加 20% FCS 和 10 % 甘油的 FAD 培養(yǎng)液
酶:
(a) 熱解素(T -7902,Sigma);
(b)0.2% 和 0.6% 胰蛋白酶(1:250);
(c)2.4U/mlⅡ型 dispase (Boehringer Mannheim)。
聚維酮碘溶液(10% 碘)
低溫保存管
50 ml 離心管
尼龍網(wǎng)
細胞濾器(BectonDickinson)
100 mm 細菌培養(yǎng)級 Petri 培養(yǎng)皿
手術(shù)刀和彎鑷
二、操作步驟
取材
1. 人皮膚常取自新生兒和幼兒的包皮,也可在手術(shù)時或尸檢后(死后 48 h 之內(nèi))取自軀干皮膚。在貼壁和增殖方面,自新生兒和幼兒的包皮分離的角質(zhì)形成細胞優(yōu)于自成人軀干皮膚分離的細胞。
2.將皮膚組織塊在聚維酮碘溶液(10% 碘)中孵育 30 min ,以預(yù)防感染。聚維酮碘溶液降低角質(zhì)形成細胞的活力不明顯。
3.用 D-PBSA 浸洗 10 min,2 次。
分離表皮最好分離全厚皮膚
4.用 Castroviejo 取皮刀(Storz Instrument) 切取全厚皮膚,厚度為 0.1~0.2 mm ??捎脧澕舫テは陆M織和部分真皮。
5. 用手術(shù)刀將皮膚切成 1 cmX2 cm 小塊。
6. 用 D-PBSA 浸洗組織塊 2~5 次。
7. 通過下列其中之一步驟用蛋白酶孵育組織塊。
(a) 胰蛋白酶:在 37℃ 條件下,將皮膚組織塊放入含有 0.6% 胰蛋白酶的 D-PBSA (pH 7.4) 中,漂浮 20~30 min。此步驟也對全厚皮膚消化很有效。
(b) 冷胰蛋白酶在 4℃ 條件下,將組織塊放人預(yù)冷的 0.2 % 胰蛋白酶中,漂浮 15~24 h 。需用酚紅顯示胰蛋白酶液的 pH, 以免 pH 變化引起酶活性和細胞活力的改變。
(c) II 型 dispase: 在 37℃ 條件下,用 2.4U/ml dispase 畔育 30 min 。
(d ) 熱解素:在 4℃ 條件下,用 0.5 mg/ml 熱解素孵育 12~16 h 。
8. 仔細觀察表皮的分離情況。當在皮膚組織塊邊緣見到表皮開始分離時,將組 織塊放人 100 mm 塑料 Petri 培養(yǎng)皿內(nèi),真皮側(cè)朝下。然后,加入 5 ml 含有血清的*培養(yǎng)液。
9. 用兩把細彎鑷剝下表皮,然后將表皮收集入含有 20 ml *培養(yǎng)液的 50 ml 離心管。
(a) 用胰蛋白酶分離時,通過用吸管輕輕吹打和用孔徑為 100um 的尼龍網(wǎng) (細胞濾器,B-DBiosciences) 過濾即可從表皮分離出有活力的角質(zhì)形成細胞。 .
(b) 從經(jīng) dispase 或熱解素消化分離的表皮獲取細胞時,需在 37℃ 條件下將表皮用胰蛋白酶和 1.3 mmol/L EDTA 液(濃度分別為 0.2% 和 0.05%) 孵育消化 10 min。
10. 用胰蛋白酶分離皮膚后,從真皮輕輕刮取附著不牢固的表皮細胞,然后將刮取的細胞加入表皮細胞懸液。如果角質(zhì)形成細胞的純度不太重要,這一方法能夠獲得較多的表皮細胞。但是,角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)中有很多間質(zhì)細胞污染。
11.通過離心(100 g,10 min) 將分離的表皮細胞用培養(yǎng)液洗 2 次。計數(shù)細胞總數(shù)和不吸收臺盼藍的活細胞數(shù)(見方案 21.1)。
原代培養(yǎng)
12. 調(diào)整細胞密度。在 37℃ 條件下,用 FAD 或 KGM 接種細胞。
(a) 3 天前將有絲分裂后的 3T3 細胞 [Rheinwald and Green,1975](見方案 14.3) 或皮膚成纖維細胞 [Limat et al,1989] 接種于培養(yǎng)皿。以 2X104~5X104 個/cm2 密度將角質(zhì)形成細胞接種在飼養(yǎng)細胞上,用 FAD 培養(yǎng)。
(b) 如不用成纖維細胞培養(yǎng),在 FAD 以高密度(1X105 ~5X105 個/cm2) 接種原代角質(zhì)形成細胞,并在傳代培養(yǎng)時保持高細胞密度。
(c) 在含有低濃度鈣離子(0.03~0.1 mmol/L 的 KGM 中,以低密度 (1X103 個/cm2) 或高密度(5X104 個/cm2) 接種細胞。用同樣的培養(yǎng)液作傳代培養(yǎng)。
(d) 在 SKDM 中,細胞貼壁和生長較慢,故最好將 SKDM 用于需要增殖活性低的實驗。
13. 1~3d 后,細胞貼壁。細胞貼壁后,用培養(yǎng)液充分浸洗細胞,除去未貼壁的死細胞和已分化的細胞。然后/加人 FAD 或 KGM ,繼續(xù)培養(yǎng):可通過調(diào)整 KGM 的鈣離子濃度促進角化和減慢生長。
傳代培養(yǎng)
14. 傳代培養(yǎng)方法如下。
(a) 用 FAD 培養(yǎng)
(i) 用 1.3~2.7 mmol/L (0.05% 0.1%) EDTA 液孵育細胞 5~15 min ,使細胞去附著。此時,可見細胞間隙變大。
(ii) 在 37℃ 條件下用 0.1% 胰蛋白酶和 1.3 mmol/L(0.05%) EDTA 液孵育細胞 5~10 min,然后用吸管輕輕吹打,使細胞充分去附著。
(b) 用 KGM 培養(yǎng)
(i) 由于 KGM 的鈣離子濃度較低,不需要用 EDTA 預(yù)處理。
(ii) 如用 FAD 培養(yǎng)方法,用 0.1% 胰蛋白酶和 1.3 mmol/L EDTA 液孵育細胞。
低溫保存
15. 為了保存大量自同種組織分離得到的細胞,常需進行低溫保存。取匯合前的原代培養(yǎng)細胞時,低溫保存效果好。
(a) 按前述的方法用胰蛋白酶消化細胞,離心(100 g,10 min)。
(b) 用含有血清的*培養(yǎng)液混懸細胞,計數(shù)。
(c) 用含有 20% FCS 和 10 % 甘油的 FAD 將細胞密度調(diào)整至 2X106 個/ml,
然后將細胞分裝人凍存管。
(d) 在 4℃ 條件下將凍存管放置 1~2 h。
(e) 用程控冷凍儀(Planer) 按 1℃/ min 的冷卻速度冷凍細胞。也可將凍存
管插人充滿異丙醇的細胞冷凍盒(如 1℃ 冷凍容器,商品號 5100-0001,NalgeNunc) 中。這樣,將細胞冷凍盒放入-80℃ 冷凍箱時,使冷卻速度適當。
(d) 細胞復蘇:
(i) 將凍存管在 37℃ 水浴中快速融化。
(ii) 用培養(yǎng)液將細胞稀釋 10 倍。
(iii) 將細胞離心后,用所需培養(yǎng)液將細胞混懸至合適密度。然后,將細胞接種于培養(yǎng)皿。