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    細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

    發(fā)布時間: 2021-10-29  點擊次數(shù): 1661次
    簡介


    一.細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理

    細(xì)胞培養(yǎng)是用酶消化法將組織碎塊分離成單個細(xì)胞,用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液,在體外適宜條件下,使細(xì)胞生長繁殖,并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。細(xì)胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)主要不同點在于原始培養(yǎng)的對象不同。細(xì)胞培養(yǎng)使用的是單個細(xì)胞懸液,組織培養(yǎng)使用的是組織塊(0.5~1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米),而器官培養(yǎng)使用的是器官原基或器官的一部分或整個器官。在組織培養(yǎng)中,細(xì)胞自組織塊周圍移出并生長,細(xì)胞在生長過程中總有移動(運動)或其它變動,這樣就使被培養(yǎng)的組織難以長期維持其原有的結(jié)構(gòu)和功能。培養(yǎng)時間越長,發(fā)生變化的可能性越大,結(jié)果常使單一類型的細(xì)胞保存下來,最終成了細(xì)胞培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)中,細(xì)胞生命活動和體內(nèi)細(xì)胞一樣,仍然是相互依存的,呈現(xiàn)一定的組織特異性,所以組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)實際上無嚴(yán)格區(qū)別。


    細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)中常用的研究手段,該方法能排除神經(jīng)體液因素的影響及肝、腎解毒功能的干擾,觀察某些因素或藥物對培養(yǎng)細(xì)胞的直接作用。通過實驗可獲得某一類型細(xì)胞的純培養(yǎng)。如心肌組織中心肌細(xì)胞約占50%,非心肌細(xì)胞占50%;而經(jīng)純化分離的心肌細(xì)胞懸液中,心肌細(xì)胞可達(dá)95%以上,這樣,心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)實驗基本不受其它細(xì)胞的干擾。在細(xì)胞培養(yǎng)實驗中能直接觀察到培養(yǎng)細(xì)胞生命活動的動態(tài)過程;用定時顯微攝影記錄可發(fā)現(xiàn)一些肉眼觀察不到的生命現(xiàn)象;還可利用電鏡手段、同位素標(biāo)記、放免法和免疫組化法等來研究細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的分布。此外,還能節(jié)約研究費用。如在某些研究中,用100只動物做實驗所獲得結(jié)論與用100張蓋玻片或幾十個培養(yǎng)瓶而獲得結(jié)論具有相同的統(tǒng)計學(xué)意義,而細(xì)胞培養(yǎng)較之大批量的動物飼養(yǎng)花費要小。


    但細(xì)胞培養(yǎng)方法也存在不足之處:培養(yǎng)細(xì)胞失去體內(nèi)細(xì)胞的制約和整體的調(diào)節(jié)作用,細(xì)胞形態(tài)和功能會發(fā)生一定程度的改變。培養(yǎng)方法、實驗試劑對細(xì)胞形態(tài)和功能有一定的影響,如胰蛋白酶可破壞細(xì)胞表面受體、酶、抗原等。長期體外培養(yǎng)的細(xì)胞,由于反復(fù)傳代、凍存和操作等因素的影響,可能發(fā)生染色體非整倍體改變,呈永生化或癌變的特征。



    材料與儀器


    二.細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備與用品
    (1)細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備

    細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備有:CO2培養(yǎng)箱,倒置顯微鏡,凈化臺,壓力蒸汽消毒器,自動雙重純水蒸餾器,液氮罐,冰箱,電熱干燥箱,電熱恒溫培養(yǎng)箱,電動吸引器,抽氣泵等。

    (2)常用的實驗用品

    1.玻璃器皿

    細(xì)胞培養(yǎng)所用的玻璃器皿應(yīng)由透明度好、無毒的中性硬質(zhì)玻璃制成。常用的有以下幾種:國產(chǎn)螺旋口培養(yǎng)瓶[有12.5毫升,25毫升,100毫升等規(guī)格,國外培養(yǎng)瓶常以底面積(平方厘米)表示];培養(yǎng)皿(直徑有3.5厘米,6厘米,9厘米,10厘米等規(guī)格);離心管(5毫升,10毫升);注射器(1毫升,5毫升等);用生理鹽水瓶代替的貯存瓶(100毫升,250毫升,500 毫升);青霉素瓶(5毫升);西力辛瓶(10毫升);其它還有尖吸管和移液管,載玻片(厚度0.8~1.2毫米),蓋玻片(厚度0.12毫米),貯存尖吸筒用的玻璃筒或金屬筒,漏斗,燒杯,量筒,貯蒸餾水瓶,冷凍管(1.5毫升,2毫升)等。

    2.塑料品

    多孔培養(yǎng)板規(guī)格有4、6、12、24、96孔等,培養(yǎng)皿直徑有3厘米、6厘米、10厘米等。塑料品經(jīng)消毒滅菌密封包裝,供一次性使用,重復(fù)使用的需經(jīng)特殊方法清洗消毒。塑料器材厚薄均勻,有的表面經(jīng)特殊處理,細(xì)胞易于生長。

    3.器械

    解剖刀、眼科剪和鑷(直頭和彎頭)、中號圓頭鑷、止血鉗等。

    4.雜用品

    金屬飯盒、試管架、各種規(guī)格膠塞、記號筆、搪瓷盤、吸頭(吸取液體的膠帽)、酒精燈、酒精、火柴、碘酒棉球瓶等。

    組織培養(yǎng)中使用最多的是吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及各種瓶塞。實驗者手中應(yīng)有三套器材,瓶塞數(shù)要大于瓶數(shù),才能保證實驗中的循環(huán)使用。



    實驗步驟


    三.細(xì)胞培養(yǎng)用品的清洗與消毒滅菌
    (1)清 洗

    1.常用玻璃器皿清洗

    ◇清洗要領(lǐng)

    浸泡

    初次使用的玻璃器皿呈堿性,表面常附有灰塵和一些對細(xì)胞有毒的物質(zhì),如鋁和砷等。空氣濕度高時,玻璃器皿表面又易長霉。使用前,新器皿浸泡在5%稀鹽酸中過夜,以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)并去除霉斑;然后經(jīng)簡單刷洗,流水沖洗(逐片進(jìn)行),蒸餾水浸泡,干燥備用。新玻片處理后,短時間不用時,需將它投入95%的酒精中保存,以防玻片長霉。培養(yǎng)后的玻璃器皿應(yīng)立即投入清水中浸泡,器皿中殘留的細(xì)胞、蛋白質(zhì)一旦干涸,即固著于玻璃表面,極難脫落。

    刷洗

    用過的玻璃器材經(jīng)自來水沖洗后,浸入水中煮沸,然后將適量洗滌劑(洗潔精或洗衣粉)投入沸水中繼續(xù)煮沸10分鐘,趁熱刷洗器皿內(nèi)外,刷洗后浸入清水中進(jìn)行沖洗。

    酸泡

    刷洗好的玻璃器材干燥后置清潔液中浸泡24小時,清潔液的強(qiáng)氧化作用可清除刷洗不掉的極微量雜質(zhì)。

    ◇清洗步驟

    玻璃器材煮沸10分鐘→刷洗→流水振蕩沖洗15-20遍→50℃烤干→清潔液浸泡24小時→流水振蕩后沖洗15-20遍→漓水→蒸餾水浸泡2次(每次24小時)→50℃烤干,待包裝。

    ◇清洗注意事項和要求

    ①使用后的實驗器材應(yīng)立即投入清水中。

    ②浸泡、煮沸、酸泡的器皿內(nèi)要充滿液體,不得有氣泡。

    ③刷洗、酸泡后的器材要用流水振蕩沖洗,不得殘留洗滌劑、清潔液。方法是:每瓶灌2/3容積的自來水,振蕩后倒掉,重復(fù)15―20次(尖滴管置量杯中沖洗)。

    ④煮沸前的水面要高于器材5厘米,水沸后投入洗滌劑(直徑35厘米的鋁鍋,用洗衣粉10克左右)。若洗滌劑和實驗器材同時從冷水煮至沸騰或使用過量洗劑,均易腐蝕玻璃表面,使玻璃堿化,pH值上升。

    ⑤軟毛刷的刷端已掉毛的應(yīng)該棄去,否則會損害玻璃。玻璃劃痕處易殘留洗滌劑,會改變培養(yǎng)液pH值和毒害細(xì)胞。

    ⑥清潔物品應(yīng)及時包裝消毒,應(yīng)注意妥善保存,防止落入灰塵、蟑螂、螞蟻等引起二次污染。

    ⑦使用后的膠塞與玻璃器材同時煮洗時,膠塞要放在煮鍋的底部。

    ⑧浸泡器材的蒸餾水容器要專用,并做好標(biāo)記,如“蒸餾水Ⅰ盆"、“蒸餾水Ⅱ盆"。

    ⑨器材清洗干燥后,在以后各步操作時,手指不可接觸器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套進(jìn)行操作,省時又保證清洗質(zhì)量。

    ⑩用超聲波儀清洗器材時,清洗要求同上。

    2.橡膠制品的清洗

    新購置的橡膠制品(膠塞、膠管、橡皮乳頭)的洗滌方法如下:0.5摩爾/升NaOH煮沸15分鐘→流水沖洗→0.5摩爾/升HCl煮沸15分鐘→流水沖洗→自來水煮沸2次→蒸餾水煮沸20分鐘→50℃烤干備用。這樣處理可*除凈膠塞上的硫磺等有毒物質(zhì)。用過的膠塞,其清洗方法、要求基本同玻璃器材。因膠塞使用面常沾有洗滌劑,流水沖不凈,故膠塞洗刷的重點部位是膠塞使用面,用刷逐個刷洗。在使用過程中,膠塞不能與培養(yǎng)液接觸,以防未洗凈的膠塞污染培養(yǎng)液和細(xì)胞。

    3.G6除菌濾器的清洗

    新G6除菌濾器置玻璃洗液中浸泡24小時,流水緩慢沖洗,至pH值為5.5左右,然后用4倍的蒸餾水緩慢沖洗,再用重蒸餾水緩慢沖洗,烤干,包裝消毒備用。用過的G6除菌漏斗立即浸泡水中(注意:濾器千萬不能干涸)過夜,流水緩慢沖洗24小時或更長時間,至濾面基本疏通時,50℃烤干,濾器再置清潔液中浸泡24小時,或裝滿清潔液自然過濾。流水沖洗及其后的處理同新G6除菌濾器。

    4.正壓除菌濾器的清洗

    新的或使用后的正壓濾器經(jīng)稀洗滌劑刷洗一次流水沖洗15分鐘→漓水→去離子水浸泡24小時→三蒸水浸泡24小時→干燥備用。

    5.塑料制品的清洗

    塑料制品質(zhì)地軟且耐腐蝕能力強(qiáng),但不耐熱,易出現(xiàn)劃痕。其清洗程序為:器皿用后立即用流水沖洗→浸于自來水中過夜→用紗布、棉簽和50℃稀洗液刷洗→流水沖洗(人工沖洗15―20遍)→晾干→浸于清潔液中15分鐘→流水沖洗→蒸餾水浸泡兩次(每次24小時)→晾干備用。

    6.清洗液的配制

    清潔液

    新配制的清潔液為棕紅色,遇有機(jī)溶劑或水分增多時變成綠色,表明失效。

    先在搪瓷盆中加入蒸餾水,加熱溶解重鉻酸鉀,再將盆置流 動自來水中,待重鉻酸鉀液冷卻后,緩慢加入濃硫酸,邊加邊用玻棒攪動,以混合液溫度不過快上升和不出現(xiàn)重鉻酸鉀結(jié)晶為度。

    玻璃濾器洗液

    取10克硝酸鈉和28.6毫升濃硫酸,放入盛有470毫升蒸餾水的玻璃缸內(nèi)混勻備用。


    清潔液配方


    配方成分
    常用方
    弱液
    次強(qiáng)液
    強(qiáng)液
    重鉻酸鉀(g)
    100
    50
    100
    60
    清水(ml)
    800
    1000
    1000
    200
    濃硫酸(ml)
    200
    90
    160
    800
    硫酸濃度(v/v)
    20%
    8%
    14%
    80%
    (2)消毒滅菌

    1.濕熱消毒

    ◇濕熱消毒的要求

    使用壓力蒸汽滅菌器進(jìn)行濕熱消毒。

    ①消毒物品不能裝得太滿,物品之間應(yīng)留有空隙,以利于消毒器內(nèi)蒸汽的流動。

    ②排氣管要插入消毒器的槽內(nèi)。若排氣管斷裂,要將排氣管與排氣閥調(diào)至同一位置。

    ③玻璃器材使用端(管口、瓶口)要向下放置。

    ④液體消毒時,用棉塞或插有針頭的膠塞封瓶口。

    ⑤加熱前將放氣閥摘子置垂直位(開放),消毒器內(nèi)空氣隨溫度升高由此閥孔逸出,容器內(nèi)冷空氣隨之排出。當(dāng)水煮沸時,有一股較急的蒸汽沖出時,將放氣閥摘子置水平位(關(guān)閉)。排除冷空氣的另一種方法是:放氣閥摘子置水平位(關(guān)閉),加熱,壓力升至5磅時,將摘子置垂直位(開放),冷、熱空氣先后排出(可用手試)。待壓力指針回歸零位時,放氣閥摘子再置水平位(關(guān)閉)。

    ⑥繼續(xù)加熱,當(dāng)消毒器內(nèi)升壓至需要壓力時,計時并使壓力恒定。壓力維持方法:用電加熱時,可通過電源和滅菌器間的穩(wěn)壓器調(diào)節(jié);沒有穩(wěn)壓器時,用放氣閥摘子自動排氣調(diào)節(jié);用煤氣加熱時,可調(diào)節(jié)火力維持壓力。根據(jù)消毒物品種類不同所選擇的消毒壓力和時間也不同,一般物品(如布類、金屬器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20分鐘;橡膠制品為10磅10分鐘;常規(guī)液體消毒15磅15分鐘。一般認(rèn)為在這種壓力下1分鐘內(nèi)幾乎可殺死所有微生物,但由于消毒物品的包裝內(nèi)仍可能留有冷空氣,而使高壓蒸汽不能達(dá)到消毒器的各部分,所以要延長消毒時間。

    ⑦消毒完畢,待壓力指針降至零位,再等數(shù)分鐘,待放氣閥摘子放完氣后打開消毒器蓋。液體瓶口棉塞換膠皮塞或拔去膠皮塞針頭換新塞。



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