細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備有：CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，凈化臺，壓力蒸汽消毒器，自動雙重純水蒸餾器，液氮罐，冰箱，電熱干燥箱，電熱恒溫培養(yǎng)箱，電動吸引器，抽氣泵等。

(2)常用的實驗用品

1.玻璃器皿

細(xì)胞培養(yǎng)所用的玻璃器皿應(yīng)由透明度好、無毒的中性硬質(zhì)玻璃制成。常用的有以下幾種：國產(chǎn)螺旋口培養(yǎng)瓶[有12．5毫升，25毫升，100毫升等規(guī)格，國外培養(yǎng)瓶常以底面積(平方厘米)表示]；培養(yǎng)皿(直徑有3．5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等規(guī)格)；離心管(5毫升，10毫升)；注射器(1毫升，5毫升等)；用生理鹽水瓶代替的貯存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升)；青霉素瓶(5毫升)；西力辛瓶(10毫升)；其它還有尖吸管和移液管，載玻片(厚度0．8～1．2毫米)，蓋玻片(厚度0．12毫米)，貯存尖吸筒用的玻璃筒或金屬筒，漏斗，燒杯，量筒，貯蒸餾水瓶，冷凍管(1．5毫升，2毫升)等。

2.塑料品

多孔培養(yǎng)板規(guī)格有4、6、12、24、96孔等，培養(yǎng)皿直徑有3厘米、6厘米、10厘米等。塑料品經(jīng)消毒滅菌密封包裝，供一次性使用，重復(fù)使用的需經(jīng)特殊方法清洗消毒。塑料器材厚薄均勻，有的表面經(jīng)特殊處理，細(xì)胞易于生長。

3.器械

解剖刀、眼科剪和鑷(直頭和彎頭)、中號圓頭鑷、止血鉗等。

4.雜用品

金屬飯盒、試管架、各種規(guī)格膠塞、記號筆、搪瓷盤、吸頭(吸取液體的膠帽)、酒精燈、酒精、火柴、碘酒棉球瓶等。

組織培養(yǎng)中使用最多的是吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及各種瓶塞。實驗者手中應(yīng)有三套器材，瓶塞數(shù)要大于瓶數(shù)，才能保證實驗中的循環(huán)使用。

1.常用玻璃器皿清洗

◇清洗要領(lǐng)

浸泡

初次使用的玻璃器皿呈堿性，表面常附有灰塵和一些對細(xì)胞有毒的物質(zhì)，如鋁和砷等。空氣濕度高時，玻璃器皿表面又易長霉。使用前，新器皿浸泡在5％稀鹽酸中過夜，以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)并去除霉斑；然后經(jīng)簡單刷洗，流水沖洗(逐片進(jìn)行)，蒸餾水浸泡，干燥備用。新玻片處理后，短時間不用時，需將它投入95％的酒精中保存，以防玻片長霉。培養(yǎng)后的玻璃器皿應(yīng)立即投入清水中浸泡，器皿中殘留的細(xì)胞、蛋白質(zhì)一旦干涸，即固著于玻璃表面，極難脫落。

刷洗

用過的玻璃器材經(jīng)自來水沖洗后，浸入水中煮沸，然后將適量洗滌劑(洗潔精或洗衣粉)投入沸水中繼續(xù)煮沸10分鐘，趁熱刷洗器皿內(nèi)外，刷洗后浸入清水中進(jìn)行沖洗。

酸泡

刷洗好的玻璃器材干燥后置清潔液中浸泡24小時，清潔液的強(qiáng)氧化作用可清除刷洗不掉的極微量雜質(zhì)。

◇清洗步驟

玻璃器材煮沸10分鐘→刷洗→流水振蕩沖洗15-20遍→50℃烤干→清潔液浸泡24小時→流水振蕩后沖洗15-20遍→漓水→蒸餾水浸泡2次(每次24小時)→50℃烤干，待包裝。

◇清洗注意事項和要求

①使用后的實驗器材應(yīng)立即投入清水中。

②浸泡、煮沸、酸泡的器皿內(nèi)要充滿液體，不得有氣泡。

③刷洗、酸泡后的器材要用流水振蕩沖洗，不得殘留洗滌劑、清潔液。方法是：每瓶灌2／3容積的自來水，振蕩后倒掉，重復(fù)15―20次(尖滴管置量杯中沖洗)。

④煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗滌劑(直徑35厘米的鋁鍋，用洗衣粉10克左右)。若洗滌劑和實驗器材同時從冷水煮至沸騰或使用過量洗劑，均易腐蝕玻璃表面，使玻璃堿化，pH值上升。

⑤軟毛刷的刷端已掉毛的應(yīng)該棄去，否則會損害玻璃。玻璃劃痕處易殘留洗滌劑，會改變培養(yǎng)液pH值和毒害細(xì)胞。

⑥清潔物品應(yīng)及時包裝消毒，應(yīng)注意妥善保存，防止落入灰塵、蟑螂、螞蟻等引起二次污染。

⑦使用后的膠塞與玻璃器材同時煮洗時，膠塞要放在煮鍋的底部。

⑧浸泡器材的蒸餾水容器要專用，并做好標(biāo)記，如“蒸餾水Ⅰ盆"、“蒸餾水Ⅱ盆"。

⑨器材清洗干燥后，在以后各步操作時，手指不可接觸器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套進(jìn)行操作，省時又保證清洗質(zhì)量。

⑩用超聲波儀清洗器材時，清洗要求同上。

2.橡膠制品的清洗

新購置的橡膠制品(膠塞、膠管、橡皮乳頭)的洗滌方法如下：0．5摩爾/升NaOH煮沸15分鐘→流水沖洗→0．5摩爾/升HCl煮沸15分鐘→流水沖洗→自來水煮沸2次→蒸餾水煮沸20分鐘→50℃烤干備用。這樣處理可*除凈膠塞上的硫磺等有毒物質(zhì)。用過的膠塞，其清洗方法、要求基本同玻璃器材。因膠塞使用面常沾有洗滌劑，流水沖不凈，故膠塞洗刷的重點部位是膠塞使用面，用刷逐個刷洗。在使用過程中，膠塞不能與培養(yǎng)液接觸，以防未洗凈的膠塞污染培養(yǎng)液和細(xì)胞。

3．G6除菌濾器的清洗

新G6除菌濾器置玻璃洗液中浸泡24小時，流水緩慢沖洗，至pH值為5．5左右，然后用4倍的蒸餾水緩慢沖洗，再用重蒸餾水緩慢沖洗，烤干，包裝消毒備用。用過的G6除菌漏斗立即浸泡水中(注意：濾器千萬不能干涸)過夜，流水緩慢沖洗24小時或更長時間，至濾面基本疏通時，50℃烤干，濾器再置清潔液中浸泡24小時，或裝滿清潔液自然過濾。流水沖洗及其后的處理同新G6除菌濾器。

4.正壓除菌濾器的清洗

新的或使用后的正壓濾器經(jīng)稀洗滌劑刷洗一次流水沖洗15分鐘→漓水→去離子水浸泡24小時→三蒸水浸泡24小時→干燥備用。

5.塑料制品的清洗

塑料制品質(zhì)地軟且耐腐蝕能力強(qiáng)，但不耐熱，易出現(xiàn)劃痕。其清洗程序為：器皿用后立即用流水沖洗→浸于自來水中過夜→用紗布、棉簽和50℃稀洗液刷洗→流水沖洗(人工沖洗15―20遍)→晾干→浸于清潔液中15分鐘→流水沖洗→蒸餾水浸泡兩次(每次24小時)→晾干備用。

6.清洗液的配制

清潔液

新配制的清潔液為棕紅色，遇有機(jī)溶劑或水分增多時變成綠色，表明失效。

先在搪瓷盆中加入蒸餾水，加熱溶解重鉻酸鉀，再將盆置流 動自來水中，待重鉻酸鉀液冷卻后，緩慢加入濃硫酸，邊加邊用玻棒攪動，以混合液溫度不過快上升和不出現(xiàn)重鉻酸鉀結(jié)晶為度。

玻璃濾器洗液

取10克硝酸鈉和28．6毫升濃硫酸，放入盛有470毫升蒸餾水的玻璃缸內(nèi)混勻備用。