免疫熒光（Immunofluorescence, IF）實驗方法

實驗步驟：

免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，細胞片的質(zhì)量對實驗的成敗至關重要，原因很簡單，如果發(fā)生細胞掉片，一切都無從談起。這一步關鍵的是玻片（Slides or Coverslips）的處理以及細胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結出許多有益的細節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當?shù)墓潭ǚ椒?，合適的固定劑和固定程序對于獲得好的實驗結果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關鍵。最后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結果。

（2） 固定。根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎?。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.

（3） 通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.

（4） 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.

（5） 一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.

（6） 二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

（一）細胞準備

用于免疫熒光實驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經(jīng)過離心后涂片的懸浮細胞或者是將取自體內(nèi)的組織細胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細胞一般在培養(yǎng)時直接放入coverslips讓細胞生長在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細胞進行免疫熒光實驗，以免后續(xù)的漂洗操作引起細胞脫落。少數(shù)實驗需要使用這類細胞或者懸浮細胞進行免疫熒光觀察，建議使用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。