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怎么提高電穿孔法轉(zhuǎn)染的效率?
發(fā)布時(shí)間: 2021-10-09 點(diǎn)擊次數(shù): 1416次電穿孔法難點(diǎn)在于提高電穿孔的效率。實(shí)驗(yàn)操作者一般能從電轉(zhuǎn)儀廠家得到轉(zhuǎn)染的詳細(xì)方案和優(yōu)化指導(dǎo)。當(dāng)你需要自己優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率時(shí),可以從以下方面進(jìn)行:
1、外加電場(chǎng)的強(qiáng)度:電壓過低,細(xì)胞膜不能形成小孔,使得外源分子通過;電壓過高,細(xì)胞會(huì)受到不可逆損傷,以至于裂解。對(duì)于大部分哺乳細(xì)胞來說,電壓250~500V/cm是合適的。實(shí)驗(yàn)操作者需要查詢資料,找到所需細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的合適電場(chǎng)強(qiáng)度。
這部分的操作建議通過逐級(jí)增加電壓來確定*佳轉(zhuǎn)染電場(chǎng)強(qiáng)度。
2、電脈沖時(shí)間的長(zhǎng)短:一般電脈沖只進(jìn)行1次。根據(jù)電轉(zhuǎn)儀的具體參數(shù)設(shè)置,不同儀器間差異較大。
3、溫度:細(xì)胞在室溫時(shí)電轉(zhuǎn)染,瞬時(shí)表達(dá)水平*高;對(duì)于高強(qiáng)度電轉(zhuǎn),產(chǎn)生大量熱量的實(shí)驗(yàn)來說,將細(xì)胞保持在0°C較好,但電轉(zhuǎn)染后需要室溫孵育一段時(shí)間。
4、DNA:線性DNA比環(huán)形DNA的轉(zhuǎn)染效率高,合適濃度是1~40μg/mL。使用質(zhì)粒時(shí),需要提高質(zhì)粒的純度。
5、培養(yǎng)基:用緩沖鹽溶液(HEPES鹽緩沖液)懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高,比使用含非離子物質(zhì)(甘露糖、蔗糖)的緩沖液高數(shù)倍。
6、細(xì)胞狀態(tài):最好使用生長(zhǎng)活躍、狀態(tài)健康、無污染、傳代次數(shù)低的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
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