干貨分享：動物過繼法去除支原體步驟

細(xì)胞長著長著然后越來越慢，然后隨便你加什么它就在那里，不增不長，甚至還翻個白眼給你看，可能是支原體感染了 怎么辦？

可以試試動物過繼法（可動物成瘤細(xì)胞的福音）:

1.取3只4-5周齡BALB/c裸鼠，每只于右側(cè)腋下皮下接種可成瘤的細(xì)胞，待腫瘤平均體積長至約1.0 X 1.0X 1.0cm3時，得到荷瘤小鼠。將荷瘤小鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%(體積百分比濃度)的乙醇水溶液中3-5 min，得到消毒后的小鼠；在超凈工作臺內(nèi)，用無菌剪刀和無菌鑷子從消毒后的小鼠胸口剪開小鼠皮膚，小心剝離得到腫瘤組織。

用眼科剪稍微剪碎腫瘤組織(此時的腫瘤組織大小為0.5 X 0.5 X 0.5cm3)，

2.加0.01mol/L PBS中浸泡(使腫瘤組織*浸潤在0.01mol/L PBS中)2min后將其取出，得到浸泡后的腫瘤組織。用眼科剪在無菌平皿上充分剪碎浸泡后的腫瘤組織(此時的腫瘤組織大小為0.2X0.2X0.2mm3)，在剪碎浸泡后的腫瘤組織的過程中適時滴加0.0 Imo I /L PBS,保持該腫瘤組織處于濕潤狀態(tài)，得到剪碎的腫瘤組織。向盛有剪碎的腫瘤組織的無菌平皿中滴加膠原酶I溶液，用I mL槍頭吹散腫瘤組織(為了能更好的吹散細(xì)胞，建議把槍頭剪掉3mm），得到膠原酶腫瘤組織混合物。

3.把膠原酶腫瘤組織混合物轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，將盛有膠原酶1-腫瘤組織混合物的50mL離心管在震蕩器上進(jìn)行震蕩3 min，得到震蕩后的膠原酶-腫瘤組織混合物，將震蕩后的膠原酶-腫瘤組織混合物在37°C水浴鍋中孵育2 min，得到膠原酶消化后的腫瘤組織，然后離心洗滌

離心洗滌操作步鄹如下：

將孵育后的膠原酶消化后的腫瘤組織于300g下離心6 min，棄上清液,加入20 mL 0.01mol/L PBS,混勾后于300g下離心6 min，再棄上清液

再加入20 mL 0.01mol/L PBS，混勾后于300g下離心6 min，棄上清液，反復(fù)三次得到膠原酶消化后的腫瘤組織。

加入該細(xì)胞的*培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天，細(xì)胞培養(yǎng)箱中CO2的體積百分比為6-8%，溫度為35-38°C，得到組織結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織，再在結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織中加入膠原酶溶液進(jìn)行消化。重復(fù)之前的離心操作步驟，

向組織結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織中加入胰酶溶液，得到胰酶-腫瘤組織混合物，將胰酶-腫瘤組織混合物在在超凈工作臺上常溫靜置1-3分鐘后，加入雙倍的胎牛血清FBS終止消化，倒掉胰酶腫瘤組織懸液，得到胰酶消化后貼壁的腫瘤單細(xì)胞。

加入細(xì)胞*培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，傳代后送STR檢測,支原體檢測，此操作可以去除大部分細(xì)胞的支原體污染并且可以提升細(xì)胞的活力。

友情提示，不足1000個字的操作方法看起來簡單，但是操作起來可能需要1-2個月的時間哦，另外原代腫瘤細(xì)胞的分離，此步驟也可參考。