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如何在WB中順利獲取大分子蛋白?
發(fā)布時(shí)間: 2021-09-17 點(diǎn)擊次數(shù): 2921次分子量大于 150Ka 的蛋白,經(jīng)常折磨我們實(shí)驗(yàn)人。想當(dāng)初,辛辛苦苦忙到深夜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯影空空如也。連續(xù)幾個(gè)月如此,內(nèi)心是何等抓狂。當(dāng)大分子條帶第一次出來的時(shí)候,心里特別開心,就像見到了初戀情人一樣??吹街車型适芾в诖蠓肿拥鞍?,想一想當(dāng)初所面對(duì)的困境。
在此,分享一下大分子蛋白的心得,希望這些經(jīng)驗(yàn)對(duì)那些與大分子蛋白奮戰(zhàn)的童鞋提供幫助。
提蛋白時(shí)應(yīng)加入 RIPA 強(qiáng)效裂解液,在 4℃環(huán)境下靜置的時(shí)間延長十分鐘到二十分鐘。這樣可以充分裂解大分子蛋白(裂解不充分,大分子蛋白的電泳速度會(huì)很慢)。電泳時(shí),電泳的時(shí)間要足夠長。
電泳全程采用 120-150V 的高電壓,使 Marker 拉開足夠大的距離。電泳時(shí)要在冰水浴中進(jìn)行。
轉(zhuǎn)膜時(shí),濕轉(zhuǎn)法與半干轉(zhuǎn)法均可以(濕轉(zhuǎn)法獲得條帶漂亮。半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜效率高),轉(zhuǎn)膜時(shí),要保留分離膠(好多分子量超過 250KDa 的蛋白就殘留在濃縮膠中!這是血的教訓(xùn)!當(dāng)初好 幾次傻傻的把濃縮膠扔了,結(jié)果神馬條帶都沒有!)。
先說濕轉(zhuǎn)法,轉(zhuǎn)膜緩沖液中甲醇濃度最高 10%,加入 SDS,使 SDS 終濃度達(dá)到 5%(大于 300KDa 的蛋白,轉(zhuǎn)膜液中 SDS 的終濃度可以到 10%)。以下摸索出來濕轉(zhuǎn)法的轉(zhuǎn)膜時(shí)間(曾經(jīng)試驗(yàn)過 30mA 小電流轉(zhuǎn)膜過夜的方法,PVDF 膜上神馬都沒有。建議大家不要嘗試?。?/p>
用半干轉(zhuǎn)時(shí)轉(zhuǎn)膜效率高。恒壓模式設(shè)置為 40V 電壓,轉(zhuǎn)膜 60-90min。一般小于 400KDa 的蛋白都能轉(zhuǎn)到 PVDF 膜上。
或者用恒流法轉(zhuǎn),電流大小設(shè)置為 PVDF 膜的面積,轉(zhuǎn)一個(gè)小時(shí)左右就可以出來。若怕轉(zhuǎn)膜過頭,可以將兩張 PVDF 膜重疊起來(總會(huì)有一張膜上有條帶)。
因?yàn)槎鄶?shù)大分子蛋白是膜蛋白,表達(dá)較少,建議延長一抗孵育時(shí)間。有一次甚至孵育了四天才出結(jié)果。大分子蛋白與 PVDF 膜的結(jié)合不是很牢固,容易脫落,因此在洗膜時(shí)要操作輕柔,不要過于粗暴,否則抗原抗體復(fù)合物容易脫落。
這些經(jīng)驗(yàn)是從幾百次失敗的實(shí)驗(yàn)中總結(jié)出來的,希望對(duì)大家有所幫助。實(shí)驗(yàn)失敗不可怕, 重要的是要勇于面對(duì),仔細(xì)思考,敢于改進(jìn)。
最后,祝大家實(shí)驗(yàn)順利,早出漂亮結(jié)果!
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